极细枝孢霉及其促进丹参根系有效成分合成的用途的制作方法

本发明涉及一种丹参根系内生真菌及其用途——用于促进丹参根系有效成分合成。

背景技术：

中药丹参(学名：salviamiltiorrhizabge.)为唇形科植物丹参的根。具有活血化瘀，凉血消痈、止痛、清心除烦等多种功效。根据其传统功效，丹参在现代广泛用于心脑血管疾病的治疗，并取得显著疗效。丹参的药用成分包括水溶性的丹酚酸类和脂溶性的丹参酮类成分。水溶性的酚酸类化合物，主要有丹酚酸a、b、c、咖啡酸、丹参素等，具有抗血栓形成、抗氧化、保护细胞、抗凝血及调节血脂等作用。丹参酮类成分主要包括丹参酮i、二氢丹参酮i、丹参酮iia、丹参酮iib、隐丹参酮、羟基丹参酮等，具有抗炎、抗菌及改善血液循环等功效。

由于丹参的市场需求大，而野生资源日益减少，栽培品种退化严重。人工引种栽培存在引种困难和环境制约等因素的影响，植物中次生代谢产物的含量不稳定，药材的质量得不到保证。因此，如何利用新的技术和手段大幅提高活性产物含量，更有效、可持续和低成本的获得丹参中有效化学成分，已成为丹参资源及活性产物研究的重要内容和发展方向。

专利号201510178706.1的发明《具有诱导丹酚酸b积累作用的丹参内生菌及其用途》公开了pseudomonaspsychrotoleranslg4，其保藏号为：cctccno:m2015085，可促进丹参毛状根中酚酸类物质(丹酚酸b)含量的积累。专利号201510176190.7的发明《具有诱导丹参毛状根酚酸积累作用的内生菌及其用途，为olivibactersolilg3，其保藏号为：cctccno:m2015084。专利号201510175259.4的发明《具有诱导酚酸积累作用的丹参内生菌及其用途为绿针假单胞菌lg1(pseudomonaschlororaphislg1)，其保藏号为：cctccno:m2015082。

2013100508029的发明《一株提高丹参产量及总酚酸含量的枝孢属真菌》告知了菌株11673-58，保藏编号为cgmccno.6608的枝孢(cladosporiumsp.)，经与丹参幼苗共生栽培4-6月，能提高收获期时丹参的产量和丹参总酚酸及丹酚酸b的含量。

《内生真菌枝孢属cladosporiumsp.对丹参生长和丹酚酸含量的影响》，告知了sm58菌株(cgmccno.6608，)不仅对丹参组培苗的株高、根长和生物量均有显著促生长作用(p<0.01)，而且对盆栽和田栽丹参的丹酚酸有效成分含量和根干重的提高也均有显著效果(p<0.01)。与对照相比较，接菌组田栽丹参的根干重、总酚酸含量、丹酚酸a的含量分别提高68％、47％、11％。

上述专利或论文告知的丹参内生菌的用途均为涉及提高丹参中水溶性成分——酚酸类物质含量，未涉及脂溶性成分丹参酮含量的提升。

申请号201611096389x的《一种提高丹参产量及其有效成分含量的内生真菌及其应用》提供了一种球毛壳菌d68(chaetomiumglobosum)，保藏编号为cgmccno.12622；还进一步公开了丹参内生真菌在提高宿主丹参生物量及丹参酮类和酚酸类成分含量的用途。该丹参内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参salviamiltiorrhizabunge植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得。

作为本行业的常识，球毛壳菌(chaetomiumglobosum)与枝孢霉(cladosporiumsp)在分类上属于不同的种属，且球毛壳菌(c.globosum)的常规用途为应用于生物防治的有益真菌；而枝孢霉属(cladosporium)的许多物种是常见的植物病原菌，也有很多物种是植物内生或共生菌，不会引起明显病害；因此球毛壳菌(c.globosum)的用途与cladosporiumsp.的用途没有可比性。

基于所见研究，植物内生菌在对宿主根系发育和次生代谢产物积累上有至关重要的作用。目前，药用植物内生菌的研究仍处于初级阶段，至今关于能产生植物源生物活性化合物的内生真菌诱导子对宿主植物次生代谢影响的报道较少，从药用植物中分离内生菌并且利用植物内生菌进行发酵生产，或在药用植物中接种特定的微生物以得到某些重要的天然药物或某种道地药材，将对解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等引起的药源匮乏、生态破坏问题有指导意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种丹参内生真菌及其用途，可促进丹参根系中丹参酮类的合成。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种丹参内生真菌df11，为极细枝孢霉cladosporiumtenuissimum，保藏编号为cgmccno.16883。

本发明还同时提供了上述丹参内生真菌df11的用途：促进丹参根系有效成分的合成、促进丹参根系的生长。

作为本发明的丹参内生真菌df11的用途的改进：所述有效成分为丹参酮类物质、丹酚酸类物质；

所述丹参酮类物质包括：隐丹参酮，二氢丹参酮，丹参酮i，丹参酮iia，

所述丹酚酸类物质包括迷迭香酸、丹酚酸b。

本发明还同时提供了一种提高丹参中有效成分含量的方法：将丹参内生真菌df11接种至丹参无菌苗根部，使丹参无菌苗与丹参内生真菌df11于(25±0.5)℃共培养；培养时间为(60±5)天。

作为本发明的提高丹参中有效成分含量的方法的改进：在每个丹参无菌苗根部接触基质处接种丹参内生真菌df11的菌悬液1ml；

菌悬液的浓度为10⁶cfu/ml。

该丹参内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参(salviamiltiorrhizabunge)根系中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为极细枝孢霉(cladosporiumtenuissimum)。

本发明所用的培养基包括：

a)改良马丁氏培养基配方：蛋白胨5.0g；磷酸氢二钾1.0g；酵母浸出粉2.0g；硫酸镁0.5g；葡萄糖20.0g；蒸馏水1000ml；ph自然；主要用于内生真菌的分离和纯化。

b)pda马铃薯固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，去离子水1000ml，ph7.2；主要用于内生真菌的活化和培养。

c)丹参无菌苗培养基：ms培养基，ph5.8；主要用于丹参无菌苗的扩繁。

d)内生真菌与丹参共培养体系：盆栽土基质为腐殖土：珍珠岩：蛭石＝1：1：l的混合栽培基质。栽培器具：1300mlpp塑料组培瓶。温室培养温度：25℃。主要用于内生真菌回接无菌苗的互作实验。

本发明的丹参酮类和酚酸类有效成分包括：隐丹参酮，二氢丹参酮，丹参酮i，丹参酮iia，迷迭香酸，丹酚酸b。

隐丹参酮，别称：隐丹参醌，英文名：cryptotanshinone，分子式：c19h20o3，cas：35825-57-1，化学结构式如下：

二氢丹参酮，英文名：dihydrotanshinone，分子式：c18h14o3，cas：20958-18-3，化学结构式如下：

其中，丹参酮i，英文名：tanshinonei，分子式：c18h12o3，cas：568-73-0，化学结构式如下：

丹参酮iia，英文名：tanshinoneiia，分子式：c19h18o3，cas：568-72-9，化学结构式如下：

迷迭香酸，英文名：rosmarinicacid，分子式：c18h16o8，cas：20283-92-5，化学结构式如下：

丹酚酸b，英文名：salvianolicacidb，分子式：c36h30o16，cas：115939-25-8，化学结构式如下：

本发明具有如下技术优势：

本发明所述的丹参内生真菌，通过和丹参植株共培养能够有效地促进丹参根系发育，还可有效促进丹参有效成分的生物合成，具有较大的应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1本发明所述丹参内生真菌的形态图；

a、b为本发明所述丹参内生真菌在pda平板培养基上的形态图，其中a为df11菌落正面的形态，b为菌落背面的形态；

c为本发明所述丹参内生真菌在光学显微镜10×100倍下形态图。

图2本发明所述丹参内生真菌df11处理60天后的丹参植株根部发育情况，a为对照(ck)，b为本发明内生真菌df11处理组。

图3为ck(对照组)与df11(本发明内生真菌处理组)的对比。

图4为ck(对照组)与df11(本发明内生真菌处理组)60天后隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮i、丹参酮iia、迷迭香酸、丹酚酸b的含量的对比。

图5是its序列片段。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、cladosporiumtenuissimumdf11的分离培养方法，依次进行以下步骤：

1)、挑选大小合适、生长健康种植于室内的丹参植株，截取长约5cm丹参根部并尽可能将附着在根表面的土壤清除干净。

2)、将截取的丹参根段用灭菌的pbs溶液冲洗2次后再用无菌水冲洗2次。然后将丹参根段浸泡在200ml已灭菌的pbs溶液中，超声震荡10min。

3)、取出丹参根，无菌水冲洗5次，将冲洗液与上一步超声震荡后的pbs溶液均匀混合，制成悬浮液。

4)、取500μl悬浮液均匀涂布于pda平板上，28℃培养24h后，进行无菌验证。

5)、如无菌落产生，则继续后续的步骤6)；如有菌落产生，则返回步骤2)继续根部处理，从而确保表面消毒彻底。

6)、将悬浮液涂布于改良马丁氏培养基上，于28℃培养5-7天；

将获得的菌株培养物接种于丹参无菌苗根部进行促进丹参根系有效成分合成的实验，挑选合成效果最佳的进行下述步骤7)；

7)、将步骤6)所得的促进丹参根系有效成分合成实验效果最佳的菌株培养物进行分离纯化，从而获得单菌种，将单菌种于相同培养基(改良马丁氏培养基)划线纯化分离，直至获得纯培养。

将此纯化后的单菌落进行its测序，经序列比对，确定菌株，并保藏，得到极细枝孢霉(cladosporiumtenuissimum)df11。

该丹参内生真菌平板及显微特征为：

菌落直径约20mm，表面绒毛状有较深皱褶，平铺在培养基表面，墨绿色。菌落边缘菌丝生长整齐，背面呈星形开裂。菌丝分支分隔，分生孢子梗呈链状，有分支呈树枝状，易断。

本发明所述的丹参内生真菌的rrna基因序列测定结果，its序列片段如图5所示。将测序结果于ncbi网站进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，与极细枝孢霉(cladosporiumtenuissimum)xchk1的相似性为99.81％。

该菌株的保藏信息如下：

保藏名称：极细枝孢霉cladosporiumtenuissimum；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏号：cgmccno.16883，保藏日期2018.11.26。

实施例2、丹参无菌苗的培养，依次进行以下步骤：

1)、选取丹参生长饱满的种子，经流水冲洗、75％酒精处理1min、无菌水漂洗、5％naclo溶液处理1～2分钟、无菌水漂洗2～3次后，用无菌滤纸吸去多余水分，播种于ms培养基中，获得丹参无菌苗。

2)、增殖苗培植：

无菌苗长出芽后，剪取1.5～2.0cm的带叶片茎段置入ms培养基中于25℃组培室进行培植，直至长成3-4片叶子的幼苗，然后将其移植到装有100mlms液体培养基和适量无菌基质(腐殖土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1体积比的混合物)的1300mlpvc塑料组培瓶中，25℃组培室培养20～30天，得到无菌苗体系。

实施例3：丹参内生真菌对丹参植株有效成分生物合成的影响：

将本发明所述的丹参无菌苗和菌株df11进行共培养，依次进行以下步骤：

(a)取本发明的丹参内生真菌df11菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的马铃薯葡萄糖液体(pda培养基)发酵瓶中，于28℃活化培养6-7天；将培养所得液进行稀释，获得浓度10⁶cfu/ml左右的菌悬液。

(b)在丹参无菌苗根部接触基质的地方接种菌悬液1ml(浓度10⁶cfu/ml左右)；丹参内生真菌与丹参共培养的盆栽土基质为腐殖土：珍珠岩：蛭石＝3：1：l(体积比)的混合栽培基质；栽培器具：1300mlpvc塑料组培瓶；温室培养温度：25℃；以此作为实验组(df11)。

以1ml的pda液体培养基代替菌悬液，其余等同于步骤(b)，所得处理称为对照组(ck)。

说明：实验组(df11)、实验组(df11)起始所用的“丹参无菌苗”一致，即，无显著性差异。

60天后观察植株生长情况，实验组处理后丹参根部较对照组明显增粗，且主根变红。

实验1、丹参植株根中有效成分含量的测定：

将实施例3培养60天所得的丹参根在45-50℃烤箱干燥直至恒重，然后研磨成粉，用甲醇提取(20mg丹参根粉末溶于2ml70％甲醇(v/v))，在超声下处理45min，10000rpm离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，提取液应用高效液相色谱(hplc)系统进行丹参酮类和丹酚酸类有效成分的分析。

所述高效液相色谱(hplc)条件为：设备：waterse2695二元高效液相色谱仪，检测器：waters2996二极管阵列检测器，色谱柱：waterssunfirec18(250mm×4.6mm,5μm)，数据采集软件：empower3。色谱条件：流速1ml/min，柱温30℃，上样体积10μl。检测波长：丹参酮类成分270nm和酚酸类成分288nm，流动相分别为0.026％磷酸水溶液和乙腈，梯度洗脱程序如下：

结合图2和图3中数据可以看出，处理组的主根和侧根数量增加变粗，颜色变红，可见丹参内生真菌df11能够促进丹参根系发育。丹参内生真菌df11对丹参植株中有效成分的含量影响更为显著(图4)，隐丹参酮，二氢丹参酮i，丹参酮i，丹参酮iia，丹酚酸b分别为对照组的35.53倍，9.63倍，8.98倍，25.49倍和1.71倍，提示df11可有效促进丹参中有效成分的生物合成。

对比例1、将“cgmccno.6608的枝孢(cladosporiumsp.)”替代本发明的df11，按照上述实施例3和实验1所述方法进行检测，隐丹参酮相对于对照组仅仅提高了5～8倍；远远低于本发明的df11。

对比例2、在发明过程中筛选到的其他菌株，隐丹参酮相对于对照组仅仅提高了约10倍；远远低于本发明的df11。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江理工大学

<120>极细枝孢霉及其促进丹参根系有效成分合成的用途

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>541

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcctgcggagggatcattacaagagacaccggtctaaccaccgggatgttcataaccctt60

tgttgtccgactctgttgcctccggggcgaccctgccttcgggcgggggctccgggtgga120

cacttcaaactcttgcgtaactttgcagtctgagtaaacttaattaataaattaaaactt180

ttaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaa240

tgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggta300

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