本发明涉及一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法。
背景技术：
：牡蛎(ostreagigastnunb)是世界上第一大养殖贝类，是人类可利用的重要海洋生物资源之一，为全球性分布种类。研究表明，牡蛎肽具有显著的体内抗氧化活性，在功能性食品、药品领域具备一定潜力。然而，通过酶解获得的牡蛎肽制品通常具备苦味，这主要是因为肽链上疏水氨基酸基团的暴露。现有技术中牡蛎肽的脱苦最有效的方法是使用外切酶将疏水氨基酸从肽链上脱除，但脱苦效果不理想；酶法脱苦通常通过延长酶解时间来提高脱苦效果，造成肽的得率降低，且风味过于复杂突出，颜色变深，并且脱苦效果并不彻底。现有的脱苦方法还包括美拉德反应法，容易造成产品颜色变深且需要长时间高温高压，造成抗氧化活性的降低。活性炭吸附法、包埋掩蔽法的脱腥脱苦效果非常有限。可见，风味不良尤其是苦味难以脱除的问题影响了牡蛎肽在食品、药品领域的应用。技术实现要素：本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种改进的脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，对外切酶脱苦工艺进行了改进，获得了风味优良单纯、脱苦效果彻底的抗氧化牡蛎肽。具体技术方案如下：一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，包括内切蛋白酶解和外切蛋白酶酶解，酶解过程中添加脱苦促进剂；所述脱苦促进剂包括海藻糖。海藻糖海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，在现有技术中的应用主要为化妆品中的保湿剂和食品中的甜味剂、稳定剂，也应用于造纸等其他工业领域。海藻糖具有大分子稳定剂的作用，因此，发明人在制备牡蛎肽时尝试添加其作为酶的保护剂。意外地发现，低用量的海藻糖能增进外切酶的脱苦效果。猜测其机理可能是低浓度的海藻糖能对极性氨基酸产生排阻作用，从而促进造成肽苦味的疏水氨基酸的暴露，疏水氨基酸的暴露进而提高了外切酶催化其脱除的效率。该方法还缩短了反应时间，提高了产率。机理推测为由于疏水氨基酸的暴露，外切酶催化脱除疏水氨基酸的效率提高，因而反应时间缩短，并且避免了极性氨基酸的过度脱除，从而提高产率。该方法还获得了色泽更浅的产品。推测其机理为海藻糖自身不发生美拉德反应，且可作为美拉德反应的阻碍剂。此外，本发明方法的外切酶作用时间较短，也防止了美拉德反应的过度发生。优选的，所述脱苦促进剂还包括羧甲基纤维素钠。实验证明，羧甲基纤维素钠对海藻糖脱苦具有协助作用。优选的，所述的内切蛋白酶酶解的具体工作条件如下：(1)取新鲜牡蛎肉洗净并破碎，按照牡蛎肉与水的质量比1：3-1：8加水匀浆，得到浆料；(2)向浆料中加入占浆料总质量0.5-2wt％的海藻糖；(3)向浆料中加入内切蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量2500-4500u/g，ph6.5-9，酶解温度45-65℃，酶解时间3-8h，然后沸水浴5-10min灭酶，得到粗酶解液。优选的，所述的内切蛋白酶为alcalase碱性蛋白酶。优选的，所述的外切蛋白酶酶解的具体工作条件如下：向内切酶酶解获得的粗酶解液中加入外切蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量1200-2500u/g，ph6-8.5、酶解温度40-55℃，酶解时间1.5-4h，然后沸水浴5-10min灭酶，离心，收集上清液，得到脱苦酶解液。优选的，还包括将外源蛋白酶酶解后获得的脱苦酶解液进行小分子脱除，脱除方法优选为透析，透析袋的截留分子量为100-500da。也可使用纳滤等方法进行小分子脱除，脱除盐、游离氨基酸及其他小分子。本发明的有益效果如下：本发明通过在酶解过程中添加海藻糖作为脱苦剂，对外切酶脱苦法进行了改进，有效解决了抗氧化牡蛎肽中苦味重的问题，同时提高了脱苦牡蛎肽的产率，缩短了脱苦反应的时间。本发明中海藻糖的添加还起到了抑制美拉德反应抑制剂的作用，获得了颜色浅、味道单纯的产物。本发明方法成本低、操作简单，不需要再现有技术基础上添加新设备，适用用抗氧化牡蛎肽的工业化生产。具体实施方式以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中使用的内切蛋白酶包括alcalase碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，alcalase碱性蛋白酶购买自诺维信公司，标示酶活2.4au/g(富林法测试其在最适标示条件下为2.3×105u/g)；木瓜蛋白酶购买自广西庞博公司，酶活1×105u/g实施例中的内切蛋白酶为风味酶，购买自广西庞博公司，酶活1×105u/g。实施例中其余物料与试剂均为市售普通物料与试剂。实施例1一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，外切蛋白酶为alcalase碱性蛋白酶，内切酶为风味酶，具体包括如下步骤：1、内切蛋白酶酶解：(1)取新鲜牡蛎肉洗净并破碎，按照牡蛎肉与水的质量比1：8加水匀浆，得到浆料；(2)向浆料中加入占浆料总质量0.5wt％的海藻糖；(3)向浆料中加入alcalase碱性蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量2500u/g，ph7，酶解温度45℃，酶解时间8h，然后沸水浴10min灭酶，得到粗酶解液。2、外切蛋白酶酶解：向内切酶酶解获得的粗酶解液中加入风味酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量1200u/g，ph7，酶解温度55℃，酶解时间4h，然后沸水浴10min灭酶，6000rpm离心15min，收集上清液，得到脱苦酶解液。3、小分子脱除：对脱苦酶解液进行纳滤，纳滤膜孔径为1nm，脱除小分子物质。实施例2一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，外切蛋白酶为alcalase碱性蛋白酶，内切酶为风味酶，具体包括如下步骤：1、内切蛋白酶酶解：(1)取新鲜牡蛎肉洗净并破碎，按照牡蛎肉与水的质量比1：3加水匀浆，得到浆料；(2)向浆料中加入占浆料总质量2wt％的海藻糖；(3)向浆料中加入alcalase碱性蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量4500u/g，ph9，酶解温度65℃，酶解时间3h，然后沸水浴5min灭酶，得到粗酶解液。2、外切蛋白酶酶解：向内切酶酶解获得的粗酶解液中加入风味酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量2500u/g，ph8，酶解温度40℃，酶解时间1.5h，然后沸水浴5min灭酶，6000rpm离心15min，收集上清液，得到脱苦酶解液。3、小分子脱除：对脱苦酶解液进行透析，透析袋的截留分子量为100da，脱除小分子物质。实施例3一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，外切蛋白酶为木瓜蛋白酶，内切酶为风味酶，具体包括如下步骤：1、内切蛋白酶酶解：(1)取新鲜牡蛎肉洗净并破碎，按照牡蛎肉与水的质量比1：5加水匀浆，得到浆料；(2)向浆料中加入占浆料总质量0.8wt％的海藻糖；(3)向浆料中加入木瓜蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量3500u/g，ph8，酶解温度55℃，酶解时间5h，然后沸水浴10min灭酶，得到粗酶解液。2、外切蛋白酶酶解：向内切酶酶解获得的粗酶解液中加入风味酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量2000u/g，ph7.5，酶解温度50℃，酶解时间2h，然后沸水浴10min灭酶，6000rpm离心15min，收集上清液，得到脱苦酶解液。3、小分子脱除：对脱苦酶解液进行透析，透析袋的截留分子量为500da，脱除小分子物质。实施例4一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，外切蛋白酶为alcalase碱性蛋白酶，内切酶为风味酶，具体包括如下步骤：1、内切蛋白酶酶解：(1)取新鲜牡蛎肉洗净并破碎，按照牡蛎肉与水的质量比1：5加水匀浆，得到浆料；(2)向浆料中加入占浆料总质量0.8wt％的海藻糖；(3)向浆料中加入alcalase碱性蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量3500u/g，ph8，酶解温度55℃，酶解时间5h，然后沸水浴10min灭酶，得到粗酶解液。2、外切蛋白酶酶解：向内切酶酶解获得的粗酶解液中加入风味酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量2000u/g，ph7.5，酶解温度50℃，酶解时间2h，然后沸水浴10min灭酶，6000rpm离心15min，收集上清液，得到脱苦酶解液。3、小分子脱除：对脱苦酶解液进行透析，透析袋的截留分子量为500da，脱除小分子物质。实施例5一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，外切蛋白酶为alcalase碱性蛋白酶，内切酶为风味酶，具体包括如下步骤：1、内切蛋白酶酶解：(1)取新鲜牡蛎肉洗净并破碎，按照牡蛎肉与水的质量比1：5加水匀浆，得到浆料；(2)向浆料中加入占浆料总质量0.8wt％的海藻糖和占浆料总质量0.1wt％的羧甲基纤维素钠；(3)向浆料中加入alcalase碱性蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量3500u/g，ph8，酶解温度55℃，酶解时间5h，然后沸水浴10min灭酶，得到粗酶解液。2、外切蛋白酶酶解：向内切酶酶解获得的粗酶解液中加入风味酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量2000u/g，ph7.5，酶解温度50℃，酶解时间2h，然后沸水浴10min灭酶，6000rpm离心15min，收集上清液，得到脱苦酶解液。3、小分子脱除：对脱苦酶解液进行透析，透析袋的截留分子量为500da，脱除小分子物质。实施例6一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，外切蛋白酶为alcalase碱性蛋白酶，内切酶为风味酶，具体包括如下步骤：1、内切蛋白酶酶解：(1)取新鲜牡蛎肉洗净并破碎，按照牡蛎肉与水的质量比1：5加水匀浆，得到浆料；(2)向浆料中加入占浆料总质量0.8wt％的海藻糖和占浆料总质量0.15wt％的羧甲基纤维素钠；(3)向浆料中加入alcalase碱性蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量3500u/g，ph8，酶解温度55℃，酶解时间5h，然后沸水浴10min灭酶，得到粗酶解液。2、外切蛋白酶酶解：向内切酶酶解获得的粗酶解液中加入风味酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量2000u/g，ph7.5，酶解温度50℃，酶解时间2h，然后沸水浴10min灭酶，6000rpm离心15min，收集上清液，得到脱苦酶解液。3、小分子脱除：对脱苦酶解液进行透析，透析袋的截留分子量为500da，脱除小分子物质。实施例7一种脱苦抗氧化牡蛎肽的制备方法，外切蛋白酶为木瓜蛋白酶，内切酶为风味酶，具体包括如下步骤：1、内切蛋白酶酶解：(1)取新鲜牡蛎肉洗净并破碎，按照牡蛎肉与水的质量比1：5加水匀浆，得到浆料；(2)向浆料中加入占浆料总质量1wt％的海藻糖和占浆料总质量0.03wt％的羧甲基纤维素钠；(3)向浆料中加入木瓜蛋白酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量3500u/g，ph8，酶解温度55℃，酶解时间5h，然后沸水浴10min灭酶，得到粗酶解液。2、外切蛋白酶酶解：向内切酶酶解获得的粗酶解液中加入风味酶，酶解条件为：酶添加量为占浆料总质量2000u/g，ph7.5，酶解温度50℃，酶解时间2h，然后沸水浴10min灭酶，6000rpm离心15min，收集上清液，得到脱苦酶解液。3、小分子脱除：对脱苦酶解液进行透析，透析袋的截留分子量为500da，脱除小分子物质。实验例实验例1实验例1除不添加海藻糖外，其他反应条件与实施例4相同。实验例2实验例1除海藻糖的添加量为占浆料总质量的4wt％，其他反应条件与实施例4相同。实验例3实验例3除羧甲基纤维素的添加量为占浆料总质量的0.3wt％外，其他反应条件与实施例5相同。实验实验1对实施例3-6、实验例1-2进行感官鉴定实验。对各组产品进行喷雾干燥，得粉末。随机选取30人，年龄范围为30-45岁，进行简单感官鉴定培训后，分别鉴定各组产品的风味和色泽并进行打分，取平均分作为最终得分。所述风味为将粉末配置成1wt％溶液的风味；所述色泽为粉末的色泽。其感官鉴定评分标准见表1，评分结果见表2。表1感官评定要求表表2感官评定得分表实施例3实施例4实施例5实施例6实验例1实验例2实验例3风味得分3.94.75.34.92.53.94.2色泽得分4.54.13.94.13.14.84.3通过表2的感官评定结果可见，海藻糖是有效的牡蛎肽脱苦剂，通过本发明的方法获得的牡蛎肽基本无苦味，也不产生外切酶作用过久造成的复杂味道；海藻糖还能抑制美拉德反应反应，是产品获得更浅的色泽，但是通过本发明方法获得的产品带有绿色调，色泽不太明亮。羧甲基纤维素钠与海藻糖共同作用能进一步促进其脱苦作用，但对色泽的改善基本没有效果。过量的海藻糖和羧甲基纤维素钠对脱苦效果反而产生一定的不利影响。此外，本发明外切酶作用时间交底即可获得理想的脱苦效果，防止了过度酶解造成的产率损失，可获得较理想的产率。海藻糖价格低廉，本方法也不需在现有技术基础上添置新设备，适用于牡蛎抗氧化肽的工业化生产。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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