表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程、免疫学及兽医生物制药领域，具体地说，涉及一种表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用。

背景技术：

犬瘟热(caninedistemp,cd)是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus,cdv)感染引起的急性、高度接触性传染病，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。该病不但可以感染犬科动物，还可以感染鼬科、浣熊科和猫科等多种动物，发病率极高，几乎可以达到100％，且临床症状多样，容易发生细菌、病毒的混合感染和继发二次感染，死亡率更是可高达80％。犬瘟热病毒属于副粘病毒科(paramyxoviridae)，副粘病毒亚科(paramyxovirinae)，麻疹病毒属(morbillivirus)，为不分节段的单负链rna病毒，粒子直径约为110-550nm，其基因组长15690bp，编码n、p、m、f、h、l和c蛋白。其中，融合蛋白(fusionprotein，f)，是受体结合蛋白，位于cdv囊膜上的i型糖蛋白，在病毒的感染、扩散环节中起到关键作用。附着或血凝素蛋白(attachmentproteinorhemagglutininprotein,h或ha)，是cdv囊膜表面上典型的ii型糖蛋白，包括胞外结构域、跨膜区以及胞质尾区，胞外结构域位于c端，胞质尾区位于n端。f蛋白可诱导机体产生中和抗体，是抗犬瘟热病毒免疫的主要抗原，抗犬瘟热病毒h蛋白的单克隆抗体具有病毒中和活性，对试验鼠的保护力强于抗f蛋白的单克隆抗体。f、h是产生中和抗体的重要抗原之一，在病毒免疫中占有重要地位，只有f和h蛋白共同作用才能使病毒进入宿主细胞内。研究发现虽然针对f蛋白的单抗不能完全中和cdv，但其诱导的免疫反应能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情况下可抑制症状的发生。病毒能够通过h蛋白吸附到细胞表面的受体上，因此，h蛋白决定了犬瘟热病毒宿主的特异性，并协助f蛋白使犬瘟热病毒以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞。多年来，幼犬主要通过接种犬瘟热弱毒苗进行免疫，但由于易受母源抗体干扰及存在热稳定性差等缺陷，常常导致免疫失败。而灭活疫苗不受血液循环抗体影响，即使血液中有抗体存在也可以接种，它在体内不能复制，可以用于免疫缺陷者。

狂犬病俗称“恐水症”，是由狂犬病病毒(rabies,rabv)引起的高致死性人兽共患传染病。病毒侵入机体的中枢神经系统，引起急性致死性脑脊髓炎，其临床症状最初为感冒、发热、头痛，很快就会出现幻觉，其特点是潜伏期长，一旦发病，致死率近乎100％。几乎所有的温血动物和人都易感，主要动物包括犬、猫、浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐狸等，可由患病动物传染至人。人或动物可通过以下途径感染狂犬病：咬伤、气溶胶传播、人类器官移植，其中咬伤是主要传播途径。目前为止尚无特效的治疗药物，最为有效的办法是通过注射狂犬病疫苗进行预防。尽管许多国家已经对犬和野生动物进行全面免疫，但仍未完全控制此病。

负链rna病毒的反向遗传操作(reversegenetic)是通过操作病毒基因组cdna制造新病毒的过程。对基因组cdna进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统可获得相应的突变或重组的负链rna病毒。基于已经建立狂犬病病毒srv9株的反向遗传系统，为进一步开展狂犬病病毒载体疫苗研制奠定了坚实的基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒的制备方法包括：以狂犬病病毒srv9株为骨架(也可以使用其他狂犬病病毒毒株)，将犬瘟热病毒h基因以及犬瘟热病毒f基因分别插入狂犬病病毒srv9cdna全长的p基因和m基因之间，或者n基因与p基因之间，或者m基因与g基因之间，或者g基因与l基因之间，最后通过反向遗传操作技术拯救分别获得重组狂犬病病毒株srv9-cdvh和srv9-cdvf；

其中，所述犬瘟热病毒f基因按5′-3′方向，由犬瘟热病毒融合蛋白的胞外区基因、狂犬病病毒g蛋白的跨膜区tm基因和胞质区cd基因串联而成。

犬瘟热病毒h基因的核苷酸序列如seqidno:1所示；

犬瘟热病毒融合蛋白的胞外区基因的核苷酸序列如seqidno:2所示；

狂犬病病毒g蛋白的跨膜区tm基因的核苷酸序列如seqidno:4所示；

狂犬病病毒g蛋白的胞质区cd基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。

第二方面，本发明提供一种组合物，其包含重组狂犬病病毒srv9-cdvh和/或srv9-cdvf，以及药学上可接受的载体。

第三方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。

第四方面，本发明提供一种疫苗组合物，其特征在于，其包含上述免疫原性组合物。

第五方面，本发明提供包含重组狂犬病病毒srv9-cdvh和/或srv9-cdvf的基因工程疫苗。

本发明提供所述基因工程疫苗在犬科动物疾病(犬瘟热与狂犬病)预防中的应用。

第六方面，本发明提供以重组狂犬病病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf或上述组合物为免疫原制备的特异性抗体。

第七方面，本发明提供重组狂犬病病毒srv9-cdvh和/或srv9-cdvf的以下任一应用：

1)用于制备治疗或预防犬瘟热病毒与狂犬病病毒感染以及由其感染所致相关疾病的疫苗或药物；

2)用于制备犬瘟热病毒与狂犬病病毒感染检测试剂或试剂盒；

3)用作疫苗载体。

第八方面，本发明提供所述基因工程疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)将重组狂犬病病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf分别接种至易感细胞进行培养，得到srv9-cdvh和srv9-cdvf病毒液；

(2)收获步骤(1)得到的重组狂犬病病毒srv9-cdvh和srv9-cdvf，灭活后与佐剂按一定比例进行混合。

优选地，所述易感细胞包括但不限于bhk、bsr、na、vero。

第九方面，本发明提供一种可用于狂犬病病毒和犬瘟热病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)对犬瘟热病毒h、f基因进行基因调取；(2)利用狂犬病病毒弱毒srv9株构建反向遗传系统，构建含有cdv-f和cdv-h基因的全长感染性克隆；(3)转染bsr细胞生产重组病毒；(4)将重组病毒灭活后制备成疫苗。

进一步地，以狂犬病病毒srv9株的反向遗传系统为骨架，将cdv-f和cdv-h基因分别插入重组质粒pd-srv9全长中的p基因和m基因之间，分别获得了重组质粒pd-srv9-cdvh和pd-srv9-cdvf-tmcd，利用重组质粒pd-srv9-cdvh、pd-srv9-cdvf-tmcd以及4种rabv辅助质粒(pd-n、pd-p、pd-l、pd-g)进行重组病毒拯救，分别获得重组狂犬病病毒株srv9-cdvf和srv9-cdvh。

其中，重组质粒pd-srv9是携带狂犬病病毒srv9株全长cdna的重组质粒。可按如下方法构建得到：对狂犬病病毒srv9株全长基因组序列进行分析，利用单一酶切位点，将srv9全长cdna分为四段。根据每段重叠区域的酶切位点拼接全长，连入pcdna3.1(+)载体中，并通过pcr方法在全长序列的3′端和5′端引入核酶hamrz、hdvrz序列，构建得到全长真核表达质粒pd-srv9。

4种rabv辅助质粒pd-n、pd-p、pd-l、pd-g的构建如下：分别对n、p、g、l1、l2、l3进行pcr扩增，根据每段重叠区域的酶切位点拼接l，分别将n、p、g、l连入pcdna3.1(+)载体中，构建得到辅助质粒pd-n、pd-p、pd-l、pd-g。具体方法可参见金宏丽等，狂犬病病毒弱毒疫苗株反向遗传操作系统的建立[j].中国病原生物学杂志,2012(7):481-485。

进一步地，构建重组质粒pd-srv9-cdvh的具体方法如下：利用cdv-h的上游引物和下游引物扩增h基因，引入核酸限制内切酶bsiwⅰ和pmeⅰ对h基因和pd-srv9质粒进行酶切处理，h基因和pd-srv9质粒的酶切产物连接转化获得重组质粒pd-srv9-cdvh。

进一步地，构建重组质粒pd-srv9-cdvf-tmcd的具体方法如下：将cdv-f的胞外区基因与rabvg蛋白的跨膜区(tm)基因及rabvg蛋白的胞质区(cd)基因相连接，构建成重组质粒pd-f-tmcd。引入核酸限制内切酶bsiwⅰ和pmeⅰ对pd-f-tmcd质粒和pd-srv9质粒进行酶切处理，酶切产物连接转化获得重组质粒pd-srv9-cdvf-tmcd。

所用引物序列见表1和表3。

第十方面，本发明提供利用重组狂犬病病毒srv9-cdvh和srv9-cdvf制备的灭活二联疫苗。将重组狂犬病病毒srv9-cdvh和srv9-cdvf-tmcd采用甲醛灭活，按等体积混合后辅以佐剂制得狂犬病病毒重组犬瘟热灭活疫苗。

本发明提供一种表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用，进一步提供一种狂犬病病毒与犬瘟热病毒灭活二联疫苗的制备方法及应用。该方法包括：以狂犬病病毒srv9株的反向遗传系统为骨架，将cdv-f、cdv-h基因分别插入狂犬病病毒全长的p基因和m基因之间，构建表达cdv-f、cdv-h蛋白的重组狂犬病病毒全长感染性克隆，转染bsr细胞后表达产生重组病毒。将所制备的重组病毒灭活后，辅以佐剂制得表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒灭活疫苗，免疫动物后能诱导产生相应的狂犬病及犬瘟热抗体效价。

本发明利用反向遗传系统拯救的狂犬病病毒载体具有病毒产量高、外源蛋白表达水平高、易于大量制备的优点，并且以狂犬病病毒为载体的重组疫苗可以参考成熟的病毒灭活、纯化工艺等。本发明制备的狂犬病病毒重组犬瘟热病毒灭活疫苗具有安全、高效、免疫后中和抗体水平高的特点，且可进行全悬浮、高效价培养，为大规模生产狂犬病-犬瘟热二联灭活疫苗奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中构建重组狂犬病病毒srv9-cdvh和srv9-cdvf的基因重组策略图。

图2为本发明实施例1中质粒pd-srv9-cdvh和质粒pd-srv9-cdvf-tmcd的酶切鉴定电泳图。a：质粒pd-srv9-cdvh酶切鉴定图，1为marker15000，2为质粒pd-srv9-cdvh经bsiwⅰ和pmeⅰ双酶切；b：质粒pd-srv9-cdvf-tmcd酶切鉴定图，1为质粒pd-srv9-cdvf-tmcd经bsiwⅰ和pmeⅰ双酶切，2为marker15000，3为marker2000。

图3为本发明实施例1中重组狂犬病病毒srv9-cdvh和srv9-cdvf拯救后免疫荧光鉴定结果。

图4为本发明实施例2中重组狂犬病病毒在bhk悬浮细胞上不同接毒量的病毒生长曲线。a：按照moi＝1接毒后病毒生长曲线；b：按照moi＝0.5接毒后病毒生长曲线。

图5为本发明实施例2中重组狂犬病病毒在bhk悬浮细胞上更换新鲜培养液的病毒生长曲线。

图6为本发明实施例3中重组狂犬病病毒srv9-cdvh的传代稳定性。其中，1为f2代重组病毒，2为f4代重组病毒，3为f6代重组病毒，4为f8代重组病毒，5为f10代重组病毒，6为f12代重组病毒，7为f14代重组病毒，8为f16代重组病毒，9为f20代重组病毒，10为f24代重组病毒，11为f28代重组病毒，12为阴性对照，m为dnamarker2000。

图7为本发明实施例3中重组狂犬病病毒srv9-cdvf的传代稳定性。其中，1为f2代重组病毒，2为f4代重组病毒，3为f6代重组病毒，4为f8代重组病毒，5为f10代重组病毒，6为f12代重组病毒，7为f14代重组病毒，8为f16代重组病毒，9为f20代重组病毒，10为f24代重组病毒，11为f28代重组病毒，12为阴性对照，m为dnamarker2000。

图8为本发明实施例4中重组狂犬病病毒免疫小鼠后的血清cdv中和抗体效价检测结果。

图9为本发明实施例4中重组狂犬病病毒免疫小鼠后的血清rabv中和抗体效价检测结果。

图8和图9中，1#、2#、3#、4#分别对应于表5中1、2、3、4组，control为对照组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1表达犬瘟热病毒融合蛋白(f)和犬瘟热病毒血凝素蛋白(h)的重组狂犬病病毒的构建

1、材料

1.1质粒、细胞及抗体

狂犬病病毒全长感染性克隆质粒、bsr细胞均由长春西诺生物科技有限公司保存。fitc标记的鼠抗rabvn蛋白单克隆抗体购自fdifujirebio公司；山羊抗cdv多克隆购自vmrd公司；fitc标记的兔抗山羊荧光二抗购自sigma公司；hrp标记山羊抗鼠igg抗体为bioworld公司产品。

1.2主要试剂

axyprep质粒dna小量提取试剂盒、axyprepdna凝胶回收试剂盒均购自axygen公司；phusion超保真dna聚合酶、t4dna连接酶均为neb公司产品；hst08感受态细胞、dnamarker和primescrip反转录试剂盒均购自takara公司；fastdigest限制性内切酶、superblock封闭液、预染蛋白marker均为thermo公司产品；去内毒素质粒大提试剂盒为qiagen公司产品；脂质体lipofectamine3000转染试剂购自invitrogen公司；伊文思蓝购自优宝生物；dmem培养液、0.25％胰酶均为corning公司产品；opti-mem培养液、胎牛血清均购自giboco公司；病毒基因组rna提取试剂盒购自天根公司；考马斯亮蓝染色液购自碧云天公司；nc膜购自ge公司。

1.3实验动物

6～8周龄雌性balb/c小鼠购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

2、方法

2.1表达犬瘟热病毒血凝素蛋白(h)的重组狂犬病病毒的构建(策略见图1)

2.1.1cdv-h蛋白基因的基因获取和序列分析

通过pcr获得cdv疫苗株的h基因序列。利用primerpremier软件设计一对引物用于扩增cdv-h蛋白基因，为提高cdv-h蛋白的表达量，通过引物在目的基因的5’端加上kozak序列(gccgccacc)，引物序列见表1。引物cdv-onderh-pm-f/cdv-onderh-pm-r由吉林省库美生物科技有限公司进行合成。

表1cdv-h基因扩增引物

2.1.2目的基因的扩增及回收

利用cdv-onderh-pm-f/cdv-onderh-pm-r引物，利用phusion超保真dna聚合酶对cdv-h基因进行扩增。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照凝胶回收试剂盒说明书的操作步骤对h基因进行回收纯化，将得到的基因片段命名为cdv-h-pcr。

2.1.3酶切、连接、转化和重组质粒的提取

将cdv-h-pcr基因片段与狂犬病病毒全长感染性克隆质粒pd-srv9质粒用bsiwⅰ和pmeⅰ进行双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收。将酶切回收产物cdv-h片段基因与载体基因通过t4dna连接酶进行连接。取连接产物pd-srv9-cdvh进行转化，涂布菌液的固体培养基于30℃培养24小时，提取重组质粒。重组质粒用限制性内切酶进行双酶切鉴定，将阳性质粒送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。将测序鉴定正确的重组质粒质粒命名为pd-srv9-cdvh。使用去内毒素的质粒大量提取试剂盒大量制备重组质粒pd-srv9-cdvh将提取的质粒分装、-20℃保存备用。

2.1.4重组病毒的拯救

将重组全长感染性克隆质粒与4种rabv辅助质粒共转染bsr细胞拯救表达cvd-h蛋白的重组狂犬病病毒，拯救重组病毒时所使用的5种质粒及其具体用量见表2。bsr细胞用含5％fbs和1％青霉素-链霉素溶液(100×，青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml)的dmem在37℃、5％co2细胞培养箱培养，每2天传代一次。转染前12小时，将bsr细胞传至6孔细胞培养板，待孔内细胞长至80～90％时，使用lipofectamine3000脂质体转染试剂进行转染，具体操作步骤如下：

(1)取10μl脂质体加入到240μlopti-mem培养液中，轻柔地充分混匀，室温孵育5分钟；

(2)将pd-srv9-cdvh和4种辅助质粒加入到opti-mem培养液中，混合均匀后再加入15μlp3000试剂，终体积为250μl，充分混匀后，于室温孵育5分钟；

(3)轻柔地混匀稀释好的脂质体转染试剂与质粒dna，将充分混匀后的dna-脂质体复合物于室温孵育20分钟；

(4)孵育期间，于37℃、5％co2培养箱中取出6孔板，弃去每孔原有培养液，用dmem培养液轻柔地清洗细胞2次，每孔加入1.5mlopti-mem培养液；

(5)将孵育好的dna-脂质体复合物逐滴加入到6孔板中，将细胞置于37℃、5％co2培养箱培养5小时；

(6)弃去每孔dna-脂质体复合物，每孔加入2ml含5％fbs和1％双抗的dmem培养液，于37℃、5％co2培养箱继续培养，24小时后转移至33℃、5％co2培养箱继续培养；

(7)转染后4天，收取细胞培养上清，分装并于-80℃保存，更换新鲜的含5％fbs和1％双抗的dmem细胞培养液，2ml/孔，细胞于33℃、5％co2培养箱继续培养；

(8)转染后6天，收取细胞培养上清，分装并于-80℃保存，同时留取适量上清进行鉴定。

表2转染bsr细胞所用重组质粒及其用量

4种rabv辅助质粒pd-n、pd-p、pd-l、pd-g的构建如下：分别对n、p、g、l1、l2、l3进行pcr扩增，根据每段重叠区域的酶切位点拼接l，分别将n、p、g、l连入pcdna3.1(+)载体中，构建得到辅助质粒pd-n、pd-p、pd-l、pd-g。

2.2表达犬瘟热病毒融合蛋白(f)的重组狂犬srv9病毒的构建(策略见图1)

2.2.1cdv-f蛋白基因的基因获取和序列分析

根据从cdv野毒株中分离出的f胞外区基因的序列(序列如seqidno:2所示)，利用primerpremier软件设计一对引物用于扩增cdv-f蛋白基因，为提高cdv-f蛋白的表达量，通过引物在目的基因的5’端加上kozak序列(gccgccacc)，引物序列见表3。表中所示的引物cdv-f-pm-f/cdv-f-pm-r由吉林省库美生物科技有限公司进行合成。同时考虑到外源基因嵌合在狂犬病病毒中需要膜端锚定区，将cdv-f的胞外区基因与rabv的跨膜区(tm)基因及rabv的胞质区(cd)基因相连接(即tm-cd基因，序列如seqidno:3所示)，构建膜锚定嵌合蛋白基因。

表3cdv-f基因构建所用引物

2.2.2目的基因的扩增及回收

利用srv-tmcd-f/srv-tmcd-r引物，以pd-g质粒为模板，利用phusion超保真dna聚合酶对tm-cd基因进行扩增。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照凝胶回收试剂盒说明书的操作步骤对tm-cd基因进行回收纯化，将得到的基因片段命名为tm-cd。

利用cdv-f-pm-f/cdv-f-pm-r引物，利用phusion超保真dna聚合酶对cdv-f基因进行扩增。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照凝胶回收试剂盒说明书的操作步骤对f基因进行回收纯化，将得到的基因片段命名为cdv-f-pcr。

2.2.3酶切、连接、转化和重组质粒的提取

将tm-cd基因片段通过nhei和noti双酶切连入pcdna3.1(+)载体中，命名为pd-tmcd；将cdv-f-pcr基因片段经bsiwi和paci双酶切连入pd-tmcd中，命名为pd-f-tmcd。pd-f-tmcd通过bsiwi和pmei双酶切连入狂犬病病毒全长感染性克隆质粒pd-srv9质粒中，命名为pd-srv9-cdvf-tmcd。取连接产物pd-srv9-cdvf-tmcd进行转化，提取重组质粒。重组质粒用限制性内切酶进行双酶切鉴定，将阳性质粒送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。使用去内毒素的质粒大量提取试剂盒大量制备重组质粒pd-srv9-cdvf-tmcd将提取的质粒分装，-20℃保存备用。

2.2.4重组病毒的拯救

将重组全长感染性克隆质粒与4种rabv辅助质粒共转染bsr细胞拯救表达cdv-f蛋白的重组狂犬病病毒。具体步骤参见2.1.4。

2.3重组病毒的鉴定

2.3.1免疫荧光鉴定

将bsr细胞传至96孔细胞培养板，100μl/孔，同步接种100μl/孔收获的病毒液，同时设置正常细胞对照。将96孔板置于37℃、5％co2培养箱培养48小时。将fitc标记的抗rabvn蛋白的抗体200倍稀释，50μl/孔，孵育1小时，鉴定重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf是否成功表达rabvn蛋白。将山羊抗cdv多克隆抗体200倍稀释，50μl/孔，孵育30分钟，将fitc标记的兔抗山羊荧光二抗30000倍稀释，50μl/孔，孵育30分钟，鉴定重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf的cdv-h、cdv-f基因是否可以成功表达h、f蛋白。

2.3.2pcr鉴定

采用rt-pcr方法对重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf进行鉴定，对扩增的pcr产物进行测序和序列分析。

2.3.3wersternblot鉴定

为鉴定重组病毒中各蛋白的表达情况，进行westernblot鉴定。具体步骤如下：取培养srv9-cdvh、srv9-cdvf重组病毒后细胞裂解液分别与5×蛋白上样缓冲液充分混合，将山羊抗cdv多克隆抗体500倍稀释，孵育2小时，将hrp标记的山羊抗鼠igg抗体5000倍稀释，孵育1.5小时。

3、结果

3.1重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf的构建及鉴定

所构建的编码cdv-h、cdv-f蛋白的重组srv9感染性克隆质粒pd-srv9-cdvh、pd-srv9-cdvf-tmcd分别经双酶切鉴定。结果表明，双酶切获得的片段大小与预期片段大小一致，结果见图2(a和b)所示。将双酶切鉴定正确的质粒分别进行测序测定，测序结果与预期结果一致，表明构建的质粒完全正确。

3.2直接免疫荧光鉴定

将转染后收获的细胞培养上清接种至bsr细胞，利用fitc标记的抗rabvn蛋白的抗体进行直接免疫荧光鉴定，结果如图3所示。显微镜下可见接种细胞培养上清的bsr细胞可见成簇的绿色荧光，而正常bsr细胞对照孔则无荧光。结果表明，重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf拯救成功，可成功组装rabv。

3.3间接免疫荧光鉴定

将转染后收获的培养液上清接种至bsr细胞，利用山羊抗cdv多克隆抗体进行间接免疫荧光鉴定，结果如图3所示。显微镜下正常bhk细胞对照孔无荧光，而经重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf感染的bhk细胞可见大量绿色荧光。结果表明，已插入重组病毒pd-srv9-cdvh、pd-srv9-cdvf-tmcd基因组中的cdv-h、cdv-f基因可以成功表达h、f蛋白。

实施例2bhk细胞悬浮培养重组病毒

1、材料

1.1病毒：重组狂犬病病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf，由实施例1构建。

1.2细胞：bhk悬浮细胞、na细胞，均由长春西诺生物科技有限公司鉴定、保存。

1.3培养基：dmem培养基购自corning公司，cdbhk-21培养基均购自gbico公司。

2、方法

2.1重组病毒在bhk细胞体外生长曲线

分别将重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf按照moi＝0.5和moi＝1感染bhk悬浮细胞，在37℃、5％co2、120rpm条件下培养，培养期间于24小时、48小时、72小时、96小时、120小时收集病毒上清样品，进行病毒滴度检测，绘制病毒生长曲线。

分别将重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf按照moi＝1感染bhk悬浮细胞，在37℃、5％co2、120rpm条件下培养，培养期间于48小时病毒液离心收取上清，将细胞沉淀等体积补充培养液继续培养，96小时后病毒液离心收取上清，进行病毒滴度检测，绘制病毒生长曲线。

2.2病毒滴度测定

将病毒液使用无血清无双抗的dmem培养基进行10倍倍比稀释。在96孔板中，每孔加入100μl消化稀释好的na细胞，同步依次加入100μl/孔稀释好的病毒液，做四个重复，同时设置正常细胞对照。37℃、5％co2培养箱培养48小时。48小时后，利用fitc标记的抗rabvn蛋白的抗体进行荧光鉴定。

2.3病毒液的繁殖

bhk细胞在cdbhk-21培养基、37℃、5％co2、120rpm条件下培养，病毒按照moi＝1的剂量分别接入srv9-cdvh、srv9-cdvf的毒种，37℃培养48小时。48小时后，病毒液离心收取上清，细胞沉淀等体积补充培养液继续培养48小时。96小时后，病毒液离心收取上清，将两次收取的上清定量分装。

3、结果

生长曲线结果表明(图4，a和b)：重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf和母本病毒srv9生长特性相似，在生长动力学方面无显著差异。按照moi＝1感染bhk悬浮细胞病毒滴度最高，在感染细胞48小时之后病毒滴度到达最高并趋于稳定，在感染细胞后96小时病毒滴度下降。通过48小时更换新鲜培养液继续培养结果显示，96小时收集的病毒滴度高于48小时收集的病毒滴度，结果见图5。

实施例3重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf外源基因的遗传稳定性研究

1、材料

1.1病毒：重组狂犬病病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf，由实施例1构建。

1.2细胞：bhk悬浮细胞，由长春西诺生物科技有限公司鉴定、保存。

1.3培养基：cdbhk-21培养基购自gbico公司。

2、方法

根据重组病毒基因组中插入的cdv-h、cdv-f-tmcd基因的序列信息，利用primerpremier软件设计一对特异性引物用于rt-pcr鉴定，引物序列见表4。取第f2代、f4代、f6代、f8代、f10代、f12代、f14代、f16代、f20代、f24代和f28代的srv9-cdvh、srv9-cdvf重组狂犬病病毒，进行rna提取，反转录后，使用cdna利用特异性引物cdv-h-f/cdv-h-r、cdv-f-f/cdv-f-r进行pcr鉴定，评估重组病毒传代的遗传稳定性。上述pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，同时，另取部分pcr扩增产物送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。

表4srv9-cdvh、srv9-cdvf鉴定用引物

3、结果

为鉴定所拯救的重组病毒srv9-cdvh、srv9-cdvf在传代过程中，插入外源基因的稳定性，提取不同代次重组病毒的基因组进行rt-pcr鉴定，结果见图6、图7。可以看出，第f2、f4、f6、f8、f10、f12、f14代、f16代、f20代、f24代和f28代的重组病毒的基因组中均可检测到cdv-h、cdv-f基因，此外pcr产物经吉林省库美生物科技有限公司进行测序鉴定正确。结果表明，所插入的外源基因在重组狂犬病病毒中遗传稳定。

实施例4表达犬瘟热病毒融合蛋白(f)和犬瘟热病毒血凝素蛋白(h)的重组狂犬srv9病毒灭活疫苗的免疫原性的研究

1、材料

1.1抗原：狂犬病病毒srv9株重组犬瘟热病毒(cdv)srv9-cdvh和srv9-cdvf。

1.2灭活剂：甲醛。

1.3佐剂：铝胶佐剂、gel02佐剂、produax佐剂。

1.4实验动物：6～8周龄的健康balb/c小鼠。

2、方法

2.1灭活及检验

将两种抗原经3000rpm离心30分钟去除细胞碎片，再分别采用0.1％的甲醛溶液37℃灭活48小时。灭活48小时后，取少量灭活后的抗原按照原倍、10倍和100倍稀释后在bsr细胞上采用直接免疫荧光检测方法进行灭活检验。

2.2疫苗的制备

将经灭活的病毒与佐剂按照一定比例进行混合，4℃旋转混匀30分钟，制备成狂犬重组犬瘟热疫苗，疫苗于4℃保存。具体分组及制备情况见表5。

表5疫苗制备

2.3小鼠免疫

将balb/c小鼠随机分为5组，6只/组，按照表1分组，进行后股肌肉免疫，100μl/只。首免后第二周进行加强免疫一次，剂量与第一次相同。同时将第5组设为注射pbs对照组。

2.4采血

分别在首免后第2、4、6、8周进行小鼠眼眶后静脉丛采血，分离血清，56℃热灭活30分钟后，进行cdv中和抗体检测及rabv中和抗体检测。

2.5cdv中和抗体检测

在96孔细胞板中，每孔先加入50μl双无培养液，将血清进行2倍稀释至第6列，每个样品2个重复。将标定好的cdv-egfp病毒(参见“大熊猫犬瘟热流行病学调查与实验免疫研究“冯娜，博士论文，2017年，第40页)使用双无dmem稀释至100tcid50/50μl，加入96孔板中，50μl/孔。病毒对照孔中，每孔加入50μl双无dmem，再将已稀释好的病毒进行10倍倍比稀释，50μl/孔，做四个重复。37℃、5％co2孵育1小时后加入vero细胞，100μl/孔。37℃、5％co2培养3天，荧光显微镜下观察荧光，有egfp表达的即为阳性孔。

2.6rabv中和抗体检测

在96孔细胞板中，每孔先加入100μl双无培养液，将血清进行3倍稀释至第6列，每个样品4个重复。将标定好病毒使用双无dmem稀释至100tcid50/50μl，加入96孔板中，50μl/孔。病毒对照孔中，每孔加入150μl的双无培养液，再将已稀释好的狂犬病毒cvs-11株做4倍梯度稀释，稀释至第6列，做4个重复。细胞对照中不加病毒。37℃、5％co2温箱中感作1小时后加入50μl/孔bhk细胞。37℃5％co2温箱中培养2天。48小时后，利用fitc标记的抗rabvn蛋白的抗体进行直接免疫荧光鉴定。在荧光显微镜下观察，计算抗体效价。

3、结果

在重组混合抗原srv9-cdvh/f免疫后的小鼠血清中能够检测到cdv中和抗体效价，加强免疫后小鼠血清中的cdv中和抗体效价有所增加。与空白对照组经显著性差异分析均显示极显著差异(图8)，且cdv中和抗体可持续至少12周。

加强免疫后重组混合抗原srv9-cdvh/f所免疫的小鼠血清内均能检测到rabv中和抗体效价，且均不低于0.5iu/ml(血清中rabv抗体效价不低于0.5iu/ml即可表明对狂犬病病毒感染具有保护力)。在第4、12周时抗体效价与空白对照组通过显著性差异分析显示有显著性差异(图9)，且rabv中和抗体可至少存在12周。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

[1]周庆国，张更利.犬瘟热与常见相似疾病临诊特征的比较[j].畜牧与兽医，2000，32(3)：32～33.

[2]李维克犬瘟热病毒强毒株tm-cc反向遗传系统及表达犬细小病毒vp2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建[d].哈尔滨：东北林业大学，2014,1～126

[3]hirayaman，sendam，nakashiman，takagim，sugiyamam，yoshikaway，yamanouchik.protectiveeffectsofmonoclonalantibodiesagainstlethalcaninedistempervirusinfectioninmice.journalofgeneralvirology，1991，72(11)：2827-30.

[4]norrye，utterg，orvellc，appelmj.protectionagainstcaninedistempervirusindogsafterimmunizationwithisolatedfusionprotein.journalofvirology，1986，58(2)：536-41.

[5]wildtf，naniched，rabourdin-combec，gerlierd，malvoisine，lecouturierv，bucklandr.modeofentryofmorbilliviruses.veterinarymicrobiology.1995，(44)：267～270.

[6]闫芳,夏咸柱,李德生,等.犬瘟热减毒疫苗对小熊猫安全性与免疫原性研究[j].病毒学报,2004,20(3):275-278.

[7]陈武,陈洪汉,黄勉.弱毒疫苗接种导致小熊猫犬瘟热病毒感染的诊断[j].黑龙江畜牧兽医,2006(1):76-78.

[8]刘玉秀.犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究[d].吉林大学,2014.

[9]金宏丽,冯娜,etal.狂犬病病毒弱毒疫苗株反向遗传操作系统的建立[j].中国病原生物学杂志,2012(7):481-485.

序列表

<110>长春西诺生物科技有限公司

<120>表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用

<130>khp191116116.7

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1815

<212>dna

<213>狂犬病病毒(rabies)

<400>1

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<213>狂犬病病毒(rabies)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>狂犬病病毒(rabies)

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<210>5

<211>135

<212>dna

<213>狂犬病病毒(rabies)

<400>5

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