高通量单细胞转录组文库及制备和使用方法与流程

文档序号:21007178发布日期:2020-06-05 23:13阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于制备测序文库的方法,所述测序文库包含来自多个单细胞核或细胞的核酸,所述方法包括:

(a)在第一多个隔室中提供多个细胞核或细胞,

其中每个隔室包含细胞核或细胞的子集;

(b)在从所述细胞获得的所述细胞或细胞核的子集中标记新合成的rna;

(c)处理细胞核或细胞的每个子集中的rna分子以产生索引的细胞核或细胞,

其中所述处理包括向存在于细胞核或细胞的每个子集中的rna核酸添加第一隔室特异性索引序列以得到存在于索引的细胞核或细胞中的索引的dna核酸,

其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交或扩增;和

(d)组合所述索引的细胞核或细胞以产生合并的索引细胞核或细胞。

2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述处理包括:

使子集与逆转录酶及与rna核酸退火的引物接触,从而得到包含所述引物和模板rna分子的相应dna核苷酸序列的双链dna核酸。

3.根据权利要求2所述的方法,其中所述引物包含与mrna聚(a)尾退火的聚t核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法,其中所述处理还包括使子集与第二引物接触,其中所述第二引物包含与预定的dna核酸退火的序列。

5.根据权利要求4所述的方法,其中所述第二引物包含隔室特异性索引。

6.根据权利要求2所述的方法,其中所述引物包含与预定的rna核酸退火的序列。

7.根据权利要求6所述的方法,其中所述方法包括在不同隔室中与相同预定rna核酸的不同核苷酸退火的引物。

8.根据权利要求2所述的方法,其中所述引物包括模板转换引物。

9.根据权利要求1所述的方法,其中添加所述第一隔室特异性索引序列的所述处理包括将包含通用序列的核苷酸序列添加到所述rna核酸以得到dna核酸,和然后添加所述第一隔室特异性索引序列到所述dna核酸的两步过程。

10.一种用于制备测序文库的方法,所述测序文库包含来自多个单细胞核或细胞的核酸,所述方法包括:

(a)在第一多个隔室中提供多个细胞核或细胞,

其中每个隔室包含细胞核或细胞的子集;

(b)使每个子集与逆转录酶及与预定的rna核酸退火的引物接触,从而得到包含所述引物和模板rna核酸的相应dna核苷酸序列的双链dna核酸;

(c)处理细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以产生索引的细胞核或细胞,

其中所述处理包括向存在于细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第一隔室特异性索引序列以得到存在于索引的细胞核或细胞中的索引的核酸,

其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交或扩增;和

(d)组合所述索引的细胞核或细胞以产生合并的索引的细胞核或细胞。

11.根据权利要求10所述的方法,其中所述引物包含所述第一隔室特异性索引序列。

12.根据权利要求10所述的方法,其进一步包括在所述接触之前,标记从所述细胞获得的所述细胞或细胞核的子集中新合成的rna。

13.根据权利要求10所述的方法,其中添加所述第一隔室特异性索引序列的所述处理包括将包含通用序列的核苷酸序列添加到所述核酸和然后将所述第一隔室特异性索引序列添加到所述核酸的两步过程。

14.根据权利要求6或10所述的方法,其中所述预定rna核酸是mrna。

15.根据权利要求1或12所述的方法,其中预先存在的rna核酸和新合成的rna核酸在同一隔室中用相同的索引标记。

16.根据权利要求1或12所述的方法,其中所述标记包括在包含核苷酸标记的组合物中孵育所述多个细胞核或细胞,其中所述核苷酸标记掺入所述新合成的rna中。

17.根据权利要求16所述的方法,其中所述核苷酸标记包含核苷酸类似物、半抗原标记的核苷酸、诱变核苷酸或可以通过化学反应修饰的核苷酸。

18.根据权利要求16所述的方法,其中超过一个核苷酸标记掺入所述新合成的rna中。

19.根据权利要求18所述的方法,其中一个或多个所述核苷酸标记的比率对于不同的隔室或时间点是不同的。

20.根据权利要求1或12所述的方法,其进一步包括在所述标记之前将细胞核或细胞的子集暴露于预定的条件。

21.根据权利要求20所述的方法,其中所述预定的条件包括暴露于药剂。

22.根据权利要求21所述的方法,其中所述药剂包括蛋白质、非核糖体蛋白质、聚酮化合物、有机分子、无机分子、rna或rnai分子、碳水化合物、糖蛋白、核酸或其组合。

23.根据权利要求21所述的方法,其中所述药剂包括治疗药物。

24.根据权利要求20所述的方法,其中两个或更多个隔室的所述预定条件是不同的。

25.根据权利要求20所述的方法,其中所述暴露和所述标记同时发生,或者所述暴露在所述标记之前发生。

26.根据权利要求1或10所述的方法,还包括:

将所述合并的索引细胞核或细胞的子集分布到第二多个隔室中,并向存在于细胞核或细胞的子集中的索引的核酸添加第二索引序列以产生包含双索引的核酸片段的双索引的细胞核或细胞,其中所述添加包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座;

组合所述双索引的细胞核或细胞以产生合并的双索引细胞核或细胞。

27.根据权利要求26所述的方法,还包括:

将所述合并的双索引细胞核或细胞的子集分布到第三多个隔室中,并向存在于细胞核或细胞的子集中的索引的核酸添加第三索引序列以产生包含三索引的核酸片段的三索引细胞核或细胞,其中所述添加包括连接、杂交、引物延伸、扩增或转座;

组合所述三索引细胞核或细胞以产生合并的三索引细胞核或细胞。

28.根据权利要求26或27所述的方法,其中分布包括稀释。

29.根据权利要求26或27所述的方法,其中分布包括分选。

30.根据权利要求26或27所述的方法,其中所述添加包括在适合于将发夹连接双链体连接至包含一个或两个索引序列的核酸片段的末端的条件下使子集与所述发夹连接双链体接触。

31.根据权利要求26或27所述的方法,其中所述添加包括使包含一个或多个索引序列的核酸片段与转座体复合物接触,其中隔室中的所述转座体复合物包含转座酶和通用序列,其中所述接触进一步包括适合于所述核酸片段的片段化和所述通用序列并入核酸片段中的条件。

32.根据权利要求1或10所述的方法,其中所述添加包括所述第一隔室特异性索引序列的连接,还包括添加第二索引序列以产生包含双索引的核酸片段的双索引细胞核或细胞,其中所述添加包括转座。

33.根据权利要求26所述的方法,其中所述添加包括所述第二隔室特异性索引序列的连接,还包括添加第三索引序列以产生包含三索引的核酸片段的双索引细胞核或细胞,其中所述添加包括转座。

34.根据权利要求1、26或27中任一项所述的方法,其中所述隔室包括孔或液滴。

35.根据权利要求1、26或27中任一项所述的方法,其中所述第一多个隔室中的隔室包含50至100,000,000个细胞核或细胞。

36.根据权利要求26中任一项所述的方法,其中所述第二多个隔室中的隔室包含50至100,000,000个细胞核或细胞。

37.根据权利要求27中的任一项所述的方法,其中所述第三多个隔室中的隔室包含括50至100,000,000个细胞核或细胞。

38.根据权利要求1或10所述的方法,进一步包括从所述合并的索引细胞核或细胞获得所述索引的核酸,从而从所述多个细胞核或细胞产生测序文库。

39.根据权利要求26所述的方法,进一步包括从所述合并的双索引细胞核或细胞获得所述双索引的核酸,从而从所述多个细胞核或细胞产生测序文库。

40.根据权利要求27所述的方法,其进一步包括从所述合并的三索引细胞核或细胞获得所述三索引的核酸,从而从所述多个细胞核或细胞产生测序文库。

41.根据权利要求1-33中任一项所述的方法,还包括:

提供包含多个扩增位点的表面,

其中所述扩增位点包含至少两个具有游离3'端的附着单链捕获寡核苷酸的群体,和

使所述包含扩增位点的表面与所述包含一个、两个或三个索引序列的核酸片段接触,接触条件适合于产生多个扩增位点,每个位点包含来自含有多个索引的单个片段的扩增子克隆群体。

42.根据权利要求26或27中任一项所述的方法,其中所述隔室特异性索引序列的添加包括添加包含通用序列的核苷酸序列到所述核酸和然后添加所述隔室特异性序列到所述核酸的两步过程。

43.一种用于制备测序文库的方法,所述测序文库包含来自多个单细胞核或细胞的核酸,所述方法包括:

(a)在第一多个隔室中提供多个细胞核或细胞,

其中每个隔室包含细胞核或细胞的子集;

(b)使每个子集与逆转录酶和引物接触,从而得到包含所述引物和所述模板rna核酸的相应dna核苷酸序列的双链dna核酸;

(c)处理细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以产生索引的细胞核或细胞,

其中所述处理包括向存在于细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第一隔室特异性索引序列以得到存在于索引的细胞核或细胞中的索引的核酸,

其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座;和

(d)组合所述索引的细胞核或细胞以产生合并的索引细胞核或细胞;

(e)将所述合并的索引细胞核或细胞分布到第二多个隔室中,

其中每个隔室包含细胞核或细胞的子集;

(f)处理细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以产生双索引的细胞核或细胞,

其中所述处理包括向存在于细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第二隔室特异性索引序列以得到存在于索引的细胞核或细胞中的双索引核酸,

其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座;和

(g)组合所述双索引的细胞核或细胞以产生合并的双索引细胞核或细胞;

(h)将所述合并的双索引细胞核或细胞分布到第三多个隔室中,

其中每个隔室包含细胞核或细胞的子集;

(i)处理细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以产生三索引的细胞核或细胞,

其中所述处理包括向存在于细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第三隔室特异性索引序列以得到存在于索引的细胞核或细胞中的三索引的核酸,

其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座;和

(j)组合所述三索引的细胞核或细胞以产生合并的三索引细胞核或细胞。

44.一种用于制备测序文库的方法,该测序文库包含来自多个单细胞核或细胞的核酸,该方法包括:

(a)提供多个细胞核或细胞;

(b)使所述多个细胞核或细胞与逆转录酶和引物接触,从而得到包含所述引物和模板rna核酸的相应dna核苷酸序列的双链dna核酸;

(c)将所述细胞核或细胞分布到第一多个隔室中,

其中每个隔室包含细胞核或细胞的子集;

(d)处理细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以产生索引的细胞核或细胞,

其中所述处理包括向存在于细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第一隔室特异性索引序列以得到存在于索引的细胞核或细胞中的索引的核酸,

其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座;和

(e)组合所述索引的细胞核或细胞以产生合并的索引细胞核或细胞;

(f)将所述合并的索引细胞核或细胞分布到第二多个隔室中,

其中每个隔室包含细胞核或细胞的子集;

(g)处理细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以产生双索引的细胞核或细胞,

其中所述处理包括向存在于细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第二隔室特异性索引序列以得到存在于索引的细胞核或细胞中的双索引的核酸,

其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座;和

(h)组合所述双索引的细胞核或细胞以产生合并的双索引细胞核或细胞;

(i)将所述合并的双索引细胞核或细胞分布到第三多个隔室中,

其中每个隔室包含细胞核或细胞的子集;

(j)处理细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以产生三索引的细胞核或细胞,

其中所述处理包括向存在于细胞核或细胞的子集中的dna核酸添加第三隔室特异性索引序列以得到存在于索引的细胞核或细胞中的三索引的核酸,

其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座;和

(k)组合所述三索引的细胞核或细胞以产生合并的三索引细胞核或细胞。

45.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述引物与rna核酸退火,从而得到包含所述引物和所述模板rna分子的相应dna核苷酸序列的双链dna核酸。

46.根据权利要求45所述的方法,其中所述引物包含与mrna聚(a)尾退火的聚t核苷酸序列。

47.根据权利要求46所述的方法,其中所述接触进一步包括使子集与第二引物接触,其中所述第二引物包含与预定的dna核酸退火的序列。

48.根据权利要求47所述的方法,其中所述第二引物包含隔室特异性索引。

49.根据权利要求45所述的方法,其中所述引物包含与预定的rna核酸退火的序列。

50.根据权利要求49所述的方法,其中所述预定的rna核酸是mrna。

51.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述引物包括模板转换引物。

52.根据权利要求43或44所述的方法,其中添加所述第一、第二或第三隔室特异性索引序列中的一个或多个的所述处理包括添加包含通用序列的核苷酸序列到所述核酸,和然后添加所述第一隔室特异性索引序列到所述dna核酸的两步过程。

53.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述引物包含所述第一隔室特异性索引序列。

54.根据权利要求43或44所述的方法,其进一步包括在所述接触之前,标记从所述细胞获得的细胞或细胞核的子集中新合成的rna。

55.根据权利要求54所述的方法,其中预先存在的rna核酸和新合成的rna核酸在同一隔室中用相同的索引标记。

56.根据权利要求54所述的方法,其中所述标记包括在包含核苷酸标记的组合物中孵育所述多个细胞核或细胞,其中所述核苷酸标记掺入所述新合成的rna中。

57.根据权利要求54所述的方法,其中所述核苷酸标记包括核苷酸类似物、半抗原标记的核苷酸、诱变核苷酸或可以通过化学反应修饰的核苷酸。

58.根据权利要求54所述的方法,其中超过一个核苷酸标记掺入所述新合成的rna中。

59.根据权利要求58所述的方法,其中一个或多个所述核苷酸标记的比率对于不同的隔室或时间点是不同的。

60.如权利要求54所述的方法,其还包括在所述标记之前,将隔室的所述细胞核或细胞的子集暴露于预定条件。

61.根据权利要求60所述的方法,其中所述预定条件包括暴露于药剂。

62.根据权利要求61所述的方法,其中所述药剂包括蛋白质、非核糖体蛋白质、聚酮化合物、有机分子、无机分子、rna或rnai分子、碳水化合物、糖蛋白、核酸或其组合。

63.根据权利要求61所述的方法,其中所述药剂包括治疗药物。

64.根据权利要求60所述的方法,其中两个或更多个隔室的所述预定条件是不同的。

65.根据权利要求60所述的方法,其中所述暴露和所述标记同时发生,或者所述暴露在所述标记之前发生。

66.根据权利要求43或44所述的方法,其中多个分布之一包括稀释。

67.根据权利要求43或44所述的方法,其中多个分布之一包括分选。

68.根据权利要求43或44所述的方法,其中添加第一、第二或第三隔室特异性索引序列中的一个或多个包括在适合于发夹连接双链体与核酸片段的末端连接的条件下使子集与所述发夹连接双链体接触。

69.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述添加第一、第二或第三隔室特异性索引序列中的一个或多个包括使核酸片段与转座体复合物接触,其中隔室中的所述转座体复合物包含转座酶和通用序列,其中所述接触进一步包括适合于所述核酸片段的片段化和核苷酸序列并入核酸片段中的条件。

70.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述第一或第二隔室特异性索引的所述添加包括连接,并且后续隔室特异性索引序列的所述添加包括转座。

71.根据权利要求43或44中任一项所述的方法,其中所述隔室包括孔或液滴。

72.根据权利要求43或44中任一项所述的方法,其中所述第一多个隔室中的隔室包含50至100,000,000个细胞核或细胞。

73.根据权利要求43或44中任一项所述的方法,其中所述第二多个隔室中的隔室包含50至100,000,000个细胞核或细胞。

74.根据权利要求43或44中任一项所述的方法,其中所述第三多个隔室中的隔室包含50至100,000,000个细胞核或细胞。

75.根据权利要求43或44所述的方法,其进一步包括从所述合并的三索引细胞核或细胞获得所述三索引的核酸,从而从所述多个细胞核或细胞产生测序文库。

76.如权利要求43或44中任一项所述的方法,还包括:

提供包含多个扩增位点的表面,

其中所述扩增位点包含至少两个具有游离3'端的附着单链捕获寡核苷酸的群体,和

使包含所述扩增位点的表面与所述三索引的核酸片段接触,其条件适合于产生多个扩增位点,每个位点包含来自含有多个索引的单个片段的扩增子克隆群体。

77.一种制备包含来自多个单细胞的核酸的测序文库的方法,该方法包括:

(a)提供来自多个细胞的细胞核;

(b)将所述细胞核的子集分布到第一多个隔室中,和使每个子集与逆转录酶和引物接触,其中每个隔室中的所述引物包含与其他隔室中的第一索引序列不同的第一索引序列,以产生包含索引的核酸片段的索引细胞核;

(c)组合所述索引细胞核以生成合并的索引细胞核;

(d)将所述合并的索引细胞核的子集分布到第二多个隔室中,并在适合于发夹连接双链体与包含第一索引序列的索引核酸片段的末端连接的条件下,使每个子集与所述发夹连接双链体接触以产生包含双索引的核酸片段的双索引细胞核,其中所述发夹连接双链体包含不同于其他隔室中的第二索引序列的第二索引序列;

(e)组合所述双索引细胞核以产生合并的双索引细胞核;

(f)将所述合并的双索引细胞核的子集分布到第三多个隔室中,并使所述双索引的核酸片段经历用于第二链合成的条件;

(g)使所述双索引的核酸片段与转座体复合物接触,其中每个隔室中的转座体复合物包含转座酶和通用序列,其中所述接触包括适合于所述双索引的核酸片段的片段化和所述通用序列并入到所述双索引的核酸片段中的条件,以产生在一端包含所述第一和所述第二索引和在另一端包含所述通用序列的双索引核酸片段;

(i)将第三索引序列并入每个隔室中的所述双索引核酸片段中以产生三索引的片段;

(j)组合所述三索引的片段,从而产生包含来自所述多个单细胞的转录组核酸的测序文库。

78.根据权利要求77所述的方法,其中所述引物包含与mrna聚(a)尾退火的聚t序列。

79.根据权利要求77所述的方法,其中每个隔室的所述引物包含与预定的mrna退火的序列。

80.根据权利要求79所述的方法,其中所述方法包括在不同隔室中与相同的预定mrna的不同核苷酸退火的引物。

81.一种制备包含来自多个单细胞的核酸的转录组测序文库的方法,该方法包括:

(a)提供来自多个细胞的合并的细胞核;

(b)使所述合并的细胞核与逆转录酶和包含寡聚-dt序列的引物接触以产生包含核酸片段的合并的细胞核,所述寡聚-dt序列与mrna聚(a)尾退火;

(c)将所述合并的细胞核的子集分布到多个隔室中,并使每个子集在适合于发夹连接双链体与核酸片段的末端连接的条件下,与所述发夹连接双链体接触以产生包含索引的核酸片段的索引细胞核,其中所述发夹连接双链体包含不同于其他隔室中的索引序列的索引序列;

(d)组合所述索引细胞核以产生合并的索引细胞核;

(e)将所述合并的索引细胞核的子集分布到第二多个隔室中,并使所述索引的核酸片段经历用于第二链合成的条件;

(f)使所述索引的核酸片段与转座体复合物接触,其中每个隔室中的转座体复合物包含转座酶和通用序列,其中所述接触包括适合于所述索引的核酸片段的片段化和所述通用序列并入索引的核酸片段中的条件,以产生包含一端的所述索引和另一端的所述通用序列的索引核酸片段;

(i)将第二索引序列并入每个隔室中的所述索引核酸片段中以产生双索引片段;

(j)组合所述双索引片段,从而产生包含来自所述多个单细胞的转录组核酸的测序文库。

82.一种用于分离细胞核的方法,该方法包括:

(a)在液氮中速冻组织;

(b)减小所述组织的大小以得到处理的组织;和

(c)通过在不存在一种或多种外源酶的情况下在促进细胞裂解并保持细胞核的完整性的缓冲液中孵育从所述处理的组织提取细胞核。

83.根据权利要求82所述的方法,其中所述减小包括切碎所述组织、使所述组织经受钝力或其组合。

84.根据权利要求82所述的方法,还包括:

(d)将所述提取的细胞核暴露于交联剂以得到固定的细胞核;和

(e)洗涤所述固定的细胞核。

85.一种用于制备测序文库的试剂盒,所述试剂盒包含权利要求16或56所述的核苷酸标记和至少一种介导连接、引物延伸或扩增的酶。

86.一种用于制备测序文库的试剂盒,所述试剂盒包含与预定的核酸退火的权利要求4、6或10所述的引物和至少一种介导连接、引物延伸或扩增的酶。


技术总结
本文提供了用于制备包括来自多个单细胞的核酸的测序文库的方法。在一个实施方案中,测序文库包括代表来自多个单细胞的全转录组的核酸。在一个实施方案中,核酸包括三个索引序列。本文还提供了组合物,例如包括具有三个索引序列的核酸的组合物。

技术研发人员:F·J·斯特梅斯;J·申杜尔;曹俊越
受保护的技术使用者:伊鲁米纳公司;华盛顿大学
技术研发日:2019.06.04
技术公布日:2020.06.05
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