一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin新功能及其应用

本发明涉及一种拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin的新用途。

背景技术：

癌症是全球发病率及死亡率最高的疾病之一，是全球范围内导致人口死亡的第二大因素。除了最近兴起的免疫疗法外，有效但更加便宜的药物治疗仍是患者作为一线治疗的最佳选择。尽管局部癌症能够通过手术直接移除或通过放射性疗法成功治疗，化疗依然是晚期或转移性癌症的常用治疗方式。传统的化疗药物往往缺乏选择性，通常针对快速分裂的癌细胞发挥作用，往往不可避免地对健康的细胞及组织造成伤害，严重的将会导致患者出现一系列排斥反应(如骨髓抑制、肠粘膜炎、脱发等等)。因此，开发不具备传统化疗药物的细胞毒性、不受常见癌细胞耐药机制限制影响的新型抗癌药物具有重要的科学、临床意义。大量研究表明，部分阳离子抗菌肽在具备杀菌能力的同时对正常哺乳动物细胞无明显毒性，此外，其对癌细胞具有广谱细胞毒性，作为小分子肽，阳离子抗菌肽能够较为高效地进入肿瘤组织从而增强其作用活性或与化疗药物联用达到增强化疗药物药效的作用。目前已有许多研究表明天然抗菌肽或其相应的人工合成衍生物具有抗癌活性，一部分具有较强活性的抗菌肽的抗癌机制逐步被揭示，并投入临床实验阶段，为将来抗菌肽作为抗癌活性物质在治疗人类癌症的相关应用提供相关数据。拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin是拟穴青蟹体内存在的天然活性肽，具有良好的抗菌活性。目前，尚无scyreprocin对癌细胞的作用相关报道。

本发明通过以拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin对多株癌细胞进行体外抗癌活性试验，探讨scyreprocin抑菌癌活性的强弱，为确定拟穴青蟹体抗菌肽scyreprocin是否具有抗癌活性提供依据，同时为研发天然肽类抗癌药物奠定基础。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin的新用途。

本发明的另一目的在于提供上述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin新用途的应用。

本发明的技术方案之一：

一种拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin的新用途。所述多肽氨基酸序列具备抗癌细胞生长活性及自主穿膜活性。采用现有的基因工程重组蛋白表达技术即可获得纯度达85％以上的拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin。

本发明的技术方案之二：

一种抗癌药物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin。

本发明的技术方案之三：

一种抗癌组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin。

本发明的技术方案之四：

一种抗临床肿瘤治疗方案，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin。

本发明的技术方案之五：

上述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin在制备抗癌药物中的应用。

本发明的技术方案之六：

上述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin在制备抗癌组合物中的应用。

本发明的技术方案之七：

上述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin在临床肿瘤治疗方案中的应用。

本发明所述的抗菌蛋白来源于拟穴青蟹，其氨基酸序列为：

mkedsnildktakmtkqnkallftaggaaafmagyyyyhcnyrnpapkksgsttsqdktdaqavqslpspsgnkgkeskdpkvk(seqidno01)

scyreprocin的分子式为c396h636n106o127s4，分子量为9107.258道尔顿。经signalp4.1软件预测，scyreprocin无信号肽序列，全长84个氨基酸中包含15个带正电荷的氨基酸残基和7个带负电荷的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为9.61。该抗菌肽的亲水性平均系数为-0.968，具有较强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子抗菌肽。

采用基因工程表达技术方法即可获得纯度达85％以上的拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin。

本发明的有益效果是：

1、本发明所述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin的新用途包括：对多株人类癌细胞具有显著的生长抑制活性。

2、本发明所述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin的新用途包括：所述多肽具有自主穿膜能力，能够穿透细胞膜进入癌细胞与非癌细胞内。

3、本发明所述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin对非癌细胞无细胞毒性，具有特异抗癌细胞活性。

本发明所述拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin对人血红细胞无溶血活性，具有良好的生物友好性，可安全用于静脉注射给药方案中。

附图说明

图1为本发明实施例1中拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin对不同细胞增殖活性的影响。

图2为本发明实施例2中拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin作用后引起不同细胞凋亡效应的检测。在图2中，细胞核呈蓝色(dapl染色)，细胞凋亡阳性信号呈绿色(tunel法检测)。

图3为本发明实施例3中拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin作用对细胞成克隆能力的影响。

图4为本发明实施例4中拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin穿膜自主能力的检测。在图4中，细胞核呈蓝色(dapi染色)，scyreprocin蛋白阳性信号呈红色(细胞免疫荧光法检测)。

图5为本发明实施例5中拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin对人血红细胞溶血率的检测。溶血率小于5％为可接受的安全溶血率范围。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

下述实施例中所用拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin均为基因工程技术表达纯化获得的产物。

下述实施例涉及的细胞系有：人子宫颈癌细胞(hela)、人移行性膀胱癌细胞(t24)、小鼠肝细胞(aml12)、人肝细胞(l02)、人非小细胞肺癌细胞(ncl-h460)、人膀胱癌细胞(du145)、人肝癌细胞(hepg2)、人肺成纤维细胞(hfl1)等，均购自中国科学院上海细胞库。

实施例1拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin抑制癌细胞生长浓度的测定

本部分选取人子宫颈癌细胞(hela)、人移行性膀胱癌细胞(t24)、小鼠肝细胞(aml12)、人肝细胞(l02)、人非小细胞肺癌细胞(ncl-h460)、人膀胱癌细胞(du145)、人肝癌细胞(hepg2)作为受试细胞，进行拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin抑制细胞增殖活性的测定。

(a)将细胞在对应细胞培养液中培养至细胞接合度80-90％后，用合edta的胰酶消化并用相应细胞培养液重悬，以相应细胞培养液调整细胞密度，在96孔细胞培养板中接种细胞，置于37℃细胞培养箱在5％co2条件下过夜培养。

(b)待每孔细胞生长到接合度约70-80％时，吸去细胞培养液，用相应细胞培养液倍比稀释scyreprocin蛋白至5、10、20μm，同时设置溶剂对照组为阴性对照，每组设置3个平行样。

(c)蛋白与细胞孵育24小时后，以celltiter96aqueous试剂盒检测细胞增殖水平。

结果表明，拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin可显著抑制癌细胞系细胞的增殖活力，而对非癌细胞系细胞的增殖无显著影响。因此，拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin具有良好的特异性癌细胞生长抑制活性。

实施例2拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin诱导癌细胞凋亡的检测

本部分选取人非小细胞肺癌细胞(ncl-h460)、人移行性膀胱癌细胞(t24)、人肺成纤维细胞(hfl1)作为受试细胞，进行拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin诱导癌细胞凋亡的检测。

(a)将细胞在对应细胞培养液中培养至细胞接合度80-90％后，用含edta的胰酶消化并用相应细胞培养液重悬，以相应细胞培养液调整细胞密度，在96孔细胞培养板中接种细胞，置于37℃细胞培养箱在5％co2条件下过夜培养。

(b)待每孔细胞生长到接合度约70-80％时，吸去细胞培养液，用相应细胞培养液倍比稀释scyreprocin蛋白至1、5、10、20μm，如下设置阳性对照组、阴性对照组、待测实验组，每组设置2个平行样：

阳性对照组：加100μl相应细胞培养液，检测前使用dnase处理样品。

阴性对照组：加100μl相应细胞培养液，检测前不进行任何处理。

待测实验组：加100μl相应细胞培养液稀释的待测蛋白样品。

(c)将96孔细胞培养板置于37℃、5％co2条件下继续培养24h后，根据roche试剂盒说明书用tunel法检测原位细胞凋亡情况。

结果表明：在1μm浓度下，拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin可引起癌细胞nci-h460、t24凋亡，而对非癌细胞系细胞hfl1无影响。

实施例3拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin抑制癌细胞克隆生长能力的测定

本部分选取人子宫颈癌细胞(hela)、人移行性膀胱癌细胞(t24)、小鼠肝细胞(aml12)、人肝细胞(lo2)、人非小细胞肺癌细胞(ncl-h460)、人膀胱癌细胞(du145)、人肝癌细胞(hepg2)作为受试细胞，评价拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin对不同细胞成克隆能力的影响。

(a)将细胞在对应细胞培养液中培养至细胞接合度80-90％后，用含edta的胰酶消化并用相应细胞培养液重悬，以相应细胞培养液调整细胞密度，在6孔细胞培养板中每孔接种500个细胞，置于37℃细胞培养箱在5％co2条件下过夜培养至细胞贴壁生长；

(b)吸去细胞培养液，如下设置阴性对照组及待测实验组，每组设置3个平行：

阴性对照组：即溶剂对照组；

待测实验组：以相应细胞培养液稀释的待测蛋白样品(含scyreprocin终浓度为5μm)；

(c)蛋白与细胞孵育7天后，吸去孔中培养液，以hbss洗涤细胞3次，每次5min以充分去除残留培养液及漂浮的细胞，加入4％(w/v)多聚甲醛，于室温下固定细胞1小时，以hbss洗涤细胞3次，每次3min以去除残留的固定液；

(d)以结晶紫染液于室温下染色10-30分钟后，以hbss充分洗涤去除多余的结晶紫，空气中晾干样品，以光学显微镜下观察，并计数总细胞数大于60个细胞的克隆，统计每个样品的合格克隆数进行分析。

结果表明，scyreprocin处理后，癌细胞系细胞的成克隆能力显著下降，而非癌细胞系细胞的成克隆能力无显著变化。

实施例4拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin穿膜能力的检测

本部分选取人人子宫颈癌细胞(hela)、人移行性膀胱癌细胞(t24)、小鼠肝细胞(aml12)、人肝细胞(lo2)、人非小细胞肺癌细胞(ncl-h460)、人膀胱癌细胞(du145)、人肝癌细胞(hepg2)作为受试细胞，进行拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin的穿膜能力检测。

(a)将细胞在对应细胞培养液中培养至细胞接合度80-90％后，用含edta的胰酶消化并用相应细胞培养液重悬，以相应细胞培养液调整细胞密度，在96孔细胞培养板中接种细胞，置于37℃细胞培养箱在5％co2条件下过夜培养；

(b)待每孔细胞生长到接合度约70-80％时，吸去细胞培养液，加入合终浓度为4μmscyreprocin的细胞培养液，同时设置溶剂对照为阴性对照组；

(c)蛋白与细胞孵育24小时后，吸去孔中培养液，以hbss洗涤细胞3次，每次5min以充分去除合有scyreprocin的原培养液，加入4％(w/v)多聚甲醛，于室温下固定细胞1小时，再以hbss洗涤细胞3次，每次3min以去除残留的固定液；

(d)以合0.1％tritonx-100的3％柠檬酸溶液于冰上透化细胞样品3min，再以hbss洗涤样品3次，每次5min以去除透化液；

(e)以5％(w/v)bsa于室温封闭样品2小时后，以scyreprocin特异性抗体及相应的荧光二抗标记胞内可能存在的scyreprocin蛋白，上机前以dapi染液对细胞核进行染色，利用荧光共聚焦显微镜观察。

结果表明，拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin可在孵育后无差别穿过癌细胞系及非癌细胞系细胞的细胞膜，进入胞质内部。因此，拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin具备穿膜特性。

实施例5拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin对人类血红细胞溶血率的测定

本实施例采用人血红细胞作为受试对象，评价拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin对其的溶血比率。

(a)静脉取血5ml至含由抗凝的采血管中，离心并用生理盐水多次洗涤，除去表面白细胞，至上清液不成红色，弃上清后取1ml再用生理盐水定容至50ml，制成4％的红细胞溶液。

(b)将拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin用生理盐水倍比稀释至5、10、20μm。

(c)在96孔细胞培养板中，如下设置阳性对照组、阴性对照组及待测实验组，每组设置三个平行孔：

阳性对照组：100μlmilliq水加100μl4％红细胞溶液；

阴性对照组：100μl生理盐水加100μl4％红细胞溶液；

待测实验组：100μl待测蛋白样品加100μl4％红细胞溶液。

(d)96孔细胞培养板于室温条件下静止3h，之后用11000rpm离心3min。小心吸出100μl于新的96孔细胞培养板上，用酶标仪在570nm波长检测吸光值。

溶血率(％)＝(待测样品吸收-阴性对照吸收)/(阳性对照吸收-阴性对照吸收)×100％。溶血率超过5％视为溶血。

结果表明，拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin在测试浓度下引起的人红细胞溶血率低于5％，即不会引起溶血，具有良好的生物安全性。

工业实用性

本发明提供了一种拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin的新用途。本发明所述的抗菌蛋白来源于拟穴青蟹，采用基因工程技术表达、纯化获得。本发明首次公开了所述抗菌肽scyreprocin除具备良好的抗菌活性外，还具备穿膜功能，对多种癌细胞具有抑杀活性，同时对人非癌细胞无细胞毒性，证明该抗菌多肽具备高效特异性抗癌活性，显示出极大的应用价值，在作为抗肿瘤药物成分的研发及应用方面有良好的应用前景，具有良好的工业实用性。

序列表

<110>厦门大学

<120>一种拟穴青蟹抗菌肽scyreprocin新功能及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>84

<212>prt

<213>拟穴青蟹(scyllaparamamosain)

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