基于形态特征和生理生化指标快速判断斑玉蕈菌种衰退的方法及其应用与流程

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种基于形态特征和生理生化指标快速判断斑玉蕈菌种衰退的方法及其应用。

背景技术：

斑玉蕈（hypsizigusmarmorens），又名真姬菇、白玉菇、海鲜菇，隶属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、离褶伞科，由于味道鲜美，口感极佳，近年来风靡食用菌市场。斑玉蕈富含蛋白质、氨基酸和维生素，是一种高蛋白、低脂肪、低热量食材，具有清除体内自由基、提高免疫力、预防衰老、延长寿命的独特功效。

斑玉蕈是我国工厂化生产的主要食用菌菌类品种之一，生产周期长，从接种到采摘需要120d。使用退化的斑玉蕈菌种会出现大规模减产，增加了斑玉蕈工厂化种植的风险。因此，建立一套斑玉蕈菌种质量快速鉴定体系，明确菌种使用代数成为目前斑玉蕈工厂化亟需解决的问题。本试验通过斑玉蕈菌种连续传代培养，分析测定不同代数斑玉蕈菌种酶活性、生理特性的变化及出菇情况，探讨斑玉蕈连续传代过程中的菌种退化情况，以明确斑玉蕈菌种可使用种代数，为斑玉蕈工厂化栽培时菌种质量提供快速鉴定方法。

斑玉蕈在培养过程中菌丝分泌大量酶类，测定酶活可有效判断菌种质量，但定量测定酶活的方法操作复杂、耗时耗力，成本较高，利用菌丝特点及其平板显色法定性测定酶活适合于斑玉蕈菌种的快速检测，耗时短、成本低、结果稳定可靠，可用作工厂化菌种质量判断。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于形态特征和生理生化指标快速判断斑玉蕈菌种衰退的方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）测定菌丝生长速度、菌丝直径、锁状联合量，观察菌落形态、洁白度、浓密度：将1-13代菌种在超净工作台中定量接种至培养基中，置于25℃培养，与菌株第一代原种相比，菌丝生长速度降低率≥25%；菌丝直径降低率≥25%，锁状联合量降低量≥50%；菌丝洁白度、浓密度下降，气生菌丝量少，菌落形态出现孢子生长、角变、易黄；

（2）测定菌落淀粉酶分泌能力：淀粉酶透明圈脱色率<50%判定为菌种退化，<45%判定为退化严重；

（3）锰过氧化物酶分泌能力：锰过氧化物酶显色圈<45%判定为菌种退化，<40%判定为退化严重；

（4）lbl脱色能力：脱色率<75%判定为菌种退化，脱色率<60%判定为菌种退化严重。

所述淀粉酶分泌能力利用显色法测定淀粉酶活力，具体方法为：将菌种接种至淀粉酶测定培养基，25℃培养10d左右，去除菌落表面菌丝，并用卢戈式碘液染色测定透明圈直径；酶活指数ei=变色圈直径/平板直径。

所述淀粉酶测定培养基的配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖10g/l，可溶性淀粉2g/l，琼脂20g/l。

所述锰过氧化物酶分泌能力利用显色法测定酶活，具体方法为：将菌种接种至锰过氧化物酶测定培养基中，25℃培养10天测定变色圈直径；酶活指数ei=变色圈直径/平板直径。

所述锰过氧化物酶测定培养基的配方为：在pda培养基中加入终浓度100µl/l的愈创木酚。

所述lbl脱色能力的测定方法为：将菌种接种至lbl培养基中，每100ml接种3-5片，接种块直径0.8cm，25℃避光培养培养10-14d，测定波长615nm下的od值；脱色率=(1－a615nmstrain/a615nmblank)×100%。

将上述方法应用于快速判断斑玉蕈菌种衰退中。

本发明的优点在于：通过斑玉蕈菌种连续传代培养，分析测定不同代数斑玉蕈菌种酶活性、生理特性的变化及出菇情况，探讨斑玉蕈连续传代过程中的菌种退化情况，以明确判断斑玉蕈菌种衰退的代数、菌丝特征和酶活变化，为斑玉蕈工厂化栽培时菌种质量提供快速鉴定方法。利用菌丝特点及其平板显色法定性测定酶活适合于斑玉蕈菌种的快速检测，耗时短、成本低、结果稳定可靠，可用作工厂化菌种质量判断。

附图说明

图1为不同代数斑玉蕈菌株菌落局变形态。

图2为斑玉蕈菌丝镜检锁状联合数量比较。

图3为lbl脱色培养基脱色能力比较。

具体实施方式

1菌种

由特色食用菌品种创新与代谢工程实验室传代培养的1-13代斑玉蕈菌种。

2试剂与培养基

（1）pda（1l）：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，mgso41.5g、kh2po43g、琼脂20g、vb110mg、水1000ml，ph自然，121℃灭菌20min。

（2）脱色培养基（1l）：马铃薯200g，乳糖20g，nh4no32g，kh2po41.5g，mgso40.5g，溴百里酚蓝（btb）0.06g，ph7.0，121℃灭菌20min。

（3）淀粉酶测定培养基（1l）：马铃薯200g，葡萄糖10g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，121℃灭菌20min。

（4）卢戈式碘液：5g碘，15g碘化钾，85ml蒸馏水。

（5）锰过氧化物酶测定培养基：在pda培养基中加入愈创木酚，100µl/l，121℃灭菌20min。

3.方法

3.1菌种培养

将1-13代菌种在超净工作台中定量接种至相应培养基，置于25℃培养箱培养。

3.2菌种衰退鉴定方法

3.2.1菌丝表型

测定菌丝生长速度，微观镜检菌丝直径、锁状联合量，描述菌落形态、洁白度、浓密度。

3.2.2显色法测定酶活

（1）淀粉酶测定：选择g1、g3、g5、g7、g9、g11、g13代菌种接至测定淀粉酶的培养基，25℃培养10d左右，去除菌落表面菌丝，并用卢戈式碘液染色测定透明圈直径。

酶活指数ei=变色圈直径/平板直径。

（2）锰过氧化物酶：选择g1、g3、g5、g7、g9、g11、g13代菌种接至特定培养基，25℃培养，培养10天左右测定变色圈直径。

酶活指数ei=变色圈直径/平板直径。

3.2.3脱色能力测定

选择g1、g3、g5、g7、g9、g11、g13代菌种，定量接种至lbl培养基，每100ml接种3-5片（接种块直径0.8cm），25℃避光培养培养10-14d，测定波长615nm下的od值。

脱色率=(1－a615nmstrain/a615nmblank)×100%。

4.结果

4.1菌丝表型

根据实验室已有的出菇结果表明在农艺性状表现上，0～4代菌种的产量高，均在55g/瓶以上，菇蕾数、菇数多，整齐度好;5～10代菌种产量逐渐降低，第10代产量仅为28.7g/瓶，出菇蕾数、菇数、成品菇比例随传代次数逐渐降低。结论为斑玉蕈菌种继代培养4代以内的菌种生产特性良好，5代以后生产性能逐渐退化。

菌丝平板表型为菌丝生长速度在第5代降低15%左右，第6代降至25%左右，第13代降至40%左右。菌丝微观镜检发现随传代次数的增加菌丝直径显著变小，第5代菌丝直径降低达30%以上。随着传代次数的增加锁状联合数量急剧减少，在40倍镜下每个视野由14左右降低至0个。

随传代次数的增加菌丝洁白度、浓密度均下降，g5时开始降低，g8再次下降，气生菌丝量明显减少。菌落形态g6时出现弹射孢子生长，g7时菌落形态出现角变，g8菌丝出现变黄，由以上菌落特征可判断菌种出现衰退。图1为不同代数斑玉蕈菌株菌落局变形态，g1是正常菌株菌丝图片，g8、g10、g12、g13为出现衰退现象的图片。

4.2平板显色法测定酶活结果

4.2.1淀粉酶显色结果

淀粉酶透明圈脱色率<50%认为菌种退化，<45%认为退化严重。

4.2.2锰过氧化物酶结果

锰过氧化物酶显色圈<45%认为菌种退化，<40%认为退化严重。

4.3脱色培养基结果

脱色率<75%认为菌种退化，脱色率<60%认为菌种退化严重。

结论：斑玉蕈菌种以从子实体第一次分离的菌丝（传代少于3代）为对照，出现以下形态特点或生理生化指标变化或者两者同时出现判断为菌种衰退，继带培养5代以上，菌丝生长速度降低25%左右，菌丝显微镜观察菌丝直径减少25%以上，锁状联合数量减少50%以上，或者不能明显看到锁状联合，如图2所示，g1、g5为锁状联合数量正常的图片，g7、g9、g11、g13中锁状联合数量明显减少。菌丝洁白度、浓密度均下降，气生菌丝量明显减少。菌落形态出现孢子生长、角变、易黄，由以上特征可判断菌种出现衰退。

生理生化反应：淀粉酶透明圈脱色率<50%认为菌种退化，<45%认为退化严重。锰过氧化物酶显色圈<45%认为菌种退化，<40%认为退化严重。脱色率<75%认为菌种退化，脱色率<60%认为菌种退化严重。图3为lbl脱色培养基脱色能力比较，其中ck是空白对照，g1、g3、g5的脱色现象较明显，g7、g9、g11、g13的脱色现象不明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。