聚乙二醇化含D-氨基酸多肽的合成与酶解的促进

聚乙二醇化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进
技术领域
1.本发明涉及促进异构化多肽酶解的方法，具体是指通过多肽固相合成法将聚乙二醇（peg 200）修饰到含d-氨基酸多肽的n端，用于在浓度为50mm中性hepes缓冲液中，在一定浓度的prok存在条件下的多肽的酶解。本方法属于大分子修饰的化学生物学领域。
2.

背景技术：

3.手性在自然界中是广泛存在的，对于构成生命体蛋白质的氨基酸来讲，除了甘氨酸外的其它蛋白质氨基酸均具有两种构型，它们分别是l-氨基酸和d-氨基酸。虽然它们具有相同的分子量、分子结构，但是它们两者表现不同的物理化学性质。由于生命体选择了l-氨基酸为蛋白质的基本单元，当d-氨基酸以游离态、结合态出现在生物体内时，通常会导致相应多肽、蛋白的结构功能发生改变，导致生物体内的蛋白酶不能有效降解，这会极大程度上引发疾病（阿尔兹海默症、白内障、慢性肾病等）的发生。因此，找到一种高效、友好的去除降解方法对于医药发展具有很大的前景。
4.在过去，人们一直致力于对含d-氨基酸肽的检测研究，通过不同的检测手段（高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳、质谱法）已经确认了含d-氨基酸肽/蛋白质的存在。目前主要利用添加金属离子形成络合物以及加入化学试剂的方法引导多肽发生重排反应从而达到裂解肽键的目的。但是这些方法大部分都对生物体具有极大的毒性作用，容易导致生物体内蛋白变性，导致进一步的危险。而且，选择一种高效且专一性强的物质来完成裂解肽键的目的具有非常重要的意义。
5.蛋白酶由于其用量少、高效、专一性强，对于裂解肽键具有很强的作用效果。然而，令人遗憾的是，经过研究发现当在多肽序列中不同位置插入d-氨基酸后，会导致蛋白酶不能有效识别并降解含d-氨基酸的多肽，我们在以前的研究中发现通过改变酶解的反应条件（温度、酶浓度、ph、缓冲液等）对酶解会有一定程度的促进，但是这种促进并不十分突出，很大程度上限制了蛋白酶的应用。因此，开发出一种高效、快速的酶解方法达到对含d-氨基酸肽的酶解具有很大的应用前景。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题在于提供一种可以高效结合蛋白酶的物质，能够有效改变多肽和蛋白酶结合能力以达到酶解的目的，从酶解的角度，为除去含d-氨基酸多肽/蛋白提供了一种可靠的解决方法和思路。
7.为实现上述目的，本发明所提出的聚乙二醇（peg 200）化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进方法。其特征在于： 1．一种聚乙二醇（peg 200）化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进，其特征在于：将能聚乙二醇(peg 200)通过多肽固相合成法修饰到含d-氨基酸多肽n端，将其在50mm的中性缓冲液中与一定浓度的蛋白酶k在恒温金属浴中进行酶解反应，利用反相高效液相色谱仪
对酶解前后的峰形变化进行检测、分析，从而确定其酶解程度。
8.2．高效液相色谱法分离纯化产物多肽，并通过冷冻干燥技术得到粉末状肽，采用质谱法对得到的聚乙二醇化（peg 200）多肽进行了表征，表明聚乙二醇（peg 200）成功地接在了多肽序列上。
9.3．聚乙二醇(peg 200)的修饰对多肽的最大紫外吸收以及结构特征并没有明显影响，这保证了被修饰多肽的结构、功能的稳定性。
10.4．利用蛋白酶的高效催化能力以及专一性等优良性质，在将蛋白酶k应用于修饰聚乙二醇（peg 200）的含d-氨基酸多肽n端后，能够高效、快速切割肽键，达到降解异构化肽的目的。
11.5．能够明显增强酶解的发生，有效而且相较于未修饰peg时的酶解效率提高了大约16倍，对酶解具有较强抗性的含d-氨基酸肽来讲已经有了很大程度上的提高。
12.6．该方法具有低毒、适用性广的特点，可以广泛利用生物环境中存在的天然蛋白酶对生物体内的异构化肽进行特异性降解。
13.本发明的有益效果是：（1）合成步骤简单，条件温和。
14.（2）酶解效率高、化学选择性好。
15.（3）从酶解的角度，为除去含d-氨基酸多肽/蛋白提供了一种可靠的解决方法和思路。
附图说明
16.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
17.图1是peg修饰多肽的合成方法。
18.图2是肽5-t、6-w以及5-t-6-w-7的修饰peg前后的质谱结果。
19.图3是peg修饰肽peg-5-t、peg-6-w、peg-5-t-6-w-7-r的紫外吸收曲线。
20.图4是肽5-t、6-w、5-t-6-w-7-r和肽peg-5-t、peg-6-w、peg-5-t-6-w-7-r的cd谱图对比。
21.图5是肽5-t、6-w、5-t-6-w-7-r和肽peg-5-t、peg-6-w、peg-5-t-6-w-7-r的hplc酶解结果。
22.图6是对比peg修饰前后多肽底物的衰减速率曲线图。
具体实施方式
23.实施例1：在酶解实验中，合成的多肽序列如表1所示。此外，在室温下和ph=7.4的hepes缓冲液中，通过超微量分光光度计将peg修饰前后的各条多肽分别定量调整浓度均为0.5mg/ml。将各个确定浓度的多肽样品溶液中分别加入1.5mg/ml的蛋白酶k，在恒温金属浴中加热到50℃，每条肽分别取六个时间点（空白、0.5h、1.0h、2.0h、4.0h以及8.0h）对它们的酶解速率进行监测。结果表明，peg修饰得到的多肽与未修饰peg的肽结构没有明显改变。另外，在蛋白酶作用下，对酶解具有明显抗性的多肽，经过peg修饰后，酶解程度有了很大的提高。
24.表1 研究中合成用的多肽序列
上面结合附图对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细的说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。


技术特征：
1.一种聚乙二醇化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进，其特征在于：将能聚乙二醇(peg 200)通过多肽固相合成法修饰到含d-氨基酸多肽n端，将其在50mm的中性缓冲液中与一定浓度的蛋白酶k在恒温金属浴中进行酶解反应，利用反相高效液相色谱仪对酶解前后的峰形变化进行检测、分析，从而确定其酶解程度。2. 如权利要求1所述的一种聚乙二醇化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进，其特征在于：高效液相色谱法分离纯化产物多肽，并通过冷冻干燥技术得到粉末状肽，采用质谱法对得到的聚乙二醇化（peg 200）多肽进行了表征，表明聚乙二醇（peg 200）成功地接在了多肽序列上。3. 如权利要求1所述的一种聚乙二醇化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进，其特征在于：聚乙二醇(peg 200)的修饰对多肽的最大紫外吸收以及结构特征并没有明显影响，这保证了被修饰多肽的结构、功能的稳定性。4. 如权利要求1所述的一种聚乙二醇化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进，其特征在于：利用蛋白酶的高效催化能力以及专一性等优良性质，在将蛋白酶k应用于修饰聚乙二醇（peg 200）的含d-氨基酸多肽n端后，能够高效、快速切割肽键，达到降解异构化肽的目的。5.如权利要求1所述的一种聚乙二醇化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进，其特征在于：能够明显增强酶解的发生，有效而且相较于未修饰peg时的酶解效率提高了大约16倍，对酶解具有较强抗性的含d-氨基酸肽有了很大程度上的提高。6.如权利要求1所述的一种聚乙二醇化含d-氨基酸多肽的合成与酶解的促进，其特征在于：该方法具有低毒、适用性广的特点，可以广泛利用生物环境中存在的天然蛋白酶对生物体内的异构化肽进行特异性降解。

技术总结
聚乙二醇化含D-氨基酸多肽的合成与酶解的促进。本发明将聚乙二醇(PEG 200)对含D-氨基酸多肽进行N端修饰，通过多肽固相合成法将PEG修饰在肽链上。采用了质谱法对PEG修饰的多肽进行了检测、确认，结果表明聚乙二醇成功地修饰在了多肽序列上。此外，通过紫外-可见光谱法、圆二色光谱法以及反相高效液相色谱法对PEG修饰多肽的结构特征及酶解结果进行了表征，发现PEG修饰后多肽的最大紫外吸收峰以及CD谱图峰形与修饰前基本一致，表明PEG修饰对肽的结构没有明显改变。而通过对比未PEG修饰肽的酶解，发现PEG修饰使得肽的酶解有了很大程度上的提高。因此，PEG修饰在应用于对酶解具有抗性的含D-氨基酸肽具有很好的应用前景。氨基酸肽具有很好的应用前景。


技术研发人员：严良 吴丽 杨镜奎
受保护的技术使用者：中国科学院大学
技术研发日：2020.03.25
技术公布日：2021/9/27