一种抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法。

背景技术：

枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有机物中,是一种革兰氏阳性菌，并且其生长、繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，是一种需氧菌。枯草芽孢杆菌菌体自身可以合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类；能合成维生素b1、b2、b6、烟酸等多种b族维生素，提高动物体(人体)内干扰素和巨噬细胞的活性。枯草芽孢杆菌已经在水产养殖、植物抗病、动物饲料生产、水质净化和堆肥发酵等方面都具有和很好的应用，但是，在一些特殊领域，枯草芽孢杆菌依然是一个有害菌，如在日化产品和工业产品领域，已经有很多的文献报道从日化产品中分离得到了枯草芽孢杆菌，如陈艺彩等(2010年)从工业腐败变质样品中分离到44株芽孢杆菌属的细菌，占分离得到细菌总数的29.63％，同时，工业杀菌剂bit、mit和卡松对这些芽孢杆菌的平均最低抑菌浓度(mic)分别为：10mg/l、14mg/l和15mg/l，呈现一定的耐药性，而菌体抗药性的提高，一个非常重要的因素就是由于生物被膜的形成，生物被膜是细菌的聚集体，它的形成可以使菌体的抗药性提高10-1000倍，另外，枯草芽孢杆菌的出现导致日化产品的性状发生改变，如使日化产品变得粘稠等，因此，迫切需要寻找一定的方法来防治枯草芽孢杆菌及其生物膜在特殊领域的污染。

目前，抑制枯草芽孢杆菌生长和繁殖的方法主要是加入一定浓度的化学杀菌剂，但是由于化学杀菌剂的长期和不正当使用，使枯草芽孢杆菌对其产生了抗药性，从而引发健康风险和经济损失；虽然，目前也有使用噬菌体、蛋白酶、天然产物等防控枯草芽孢杆菌，但由于效果差、作用时间长、适用范围窄等原因，没有得到大规模应用。

技术实现要素：

本发明针对虽然枯草芽孢杆菌一直以来被作为有益菌在农业、发酵工业和畜牧业等领域得到了广泛的应用，但在某些领域或者产品中如日化产品和工业制品等，枯草芽孢杆菌的出现特别是其生物被膜的形成往往会导致一系列的问题和危害的不足，根据以菌治膜的思路，通过引入其它菌株来有效控制枯草芽孢杆菌的生物被膜形成，提供一种高效抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法。

本发明通过引入枯草芽孢杆菌的抑制菌株即大肠杆菌特定基因敲除子，通过菌菌互作抑制枯草芽孢杆菌生物膜的形成，而引入的菌株具有较低的抗药性，易于根除，以菌治菌和以菌抑膜可以作为一种新的腐败菌防治策略和技术。

本发明的抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法，其特征在于，向枯草芽孢杆菌中加入大肠杆菌基因敲除子从而抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成，所述的大肠杆菌基因敲除子为大肠杆菌bw25113敲除子δatpa、δatpb、δatpc、δatpd、δatph、δdcua、δguaa、δlpd、δpura、δsucb、δubie、δubih和δygap中的至少一种。

优选，所述的加入是通过将所述的大肠杆菌基因敲除子与所述的枯草芽孢杆菌在液相中接触来进行的。

优选，所述的加入是通过将所述的大肠杆菌基因敲除子与所述的枯草芽孢杆菌混合来进行的。

优选，所述的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌py79。

本发明还提供以大肠杆菌bw25113敲除子δatpa、δatpb、δatpc、δatpd、δatph、δdcua、δguaa、δlpd、δpura、δsucb、δubie、δubih和δygap中的至少一种作为活性成分的菌剂在抑制枯草芽孢杆菌生物被膜形成中的应用。

优选，所述的菌剂，是将大肠杆菌bw25113敲除子δatpa、δatpb、δatpc、δatpd、δatph、δdcua、δguaa、δlpd、δpura、δsucb、δubie、δubih和δygap中的至少一种接种于lb培养基中，25℃-37℃培养得到的。

本发明中所使用的大肠杆菌bw25113敲除子，包括：δatpa、δatpb、δatpc、δatpd、δatph、δdcua、δguaa、δlpd、δpura、δsucb、δubie、δubih和δygap，上述的敲除子中依次对应敲除的基因为：atpa是atp合成酶f1复合体α亚单位(atpsynthasef1alphasubunit)、atpb是atp合成酶fo复合体亚单位(atpsynthasefocomplexsubunit)、atpc是atp合成酶f1复合体ε亚单位(atpsynthasef1complexsubunitepsilon)、atpd是atp合成酶f1复合体β亚单位(atpsynthasef1complexsubunitbeta)、atph是atp合成酶f1复合体δ亚单位(atpsynthasef1complexsubunitdelta)、dcua是c4二羧酸转运体(c4-dicarboxylatetransporter)、guaa是鸟嘌呤核苷酸合成酶(gmpsynthetase)、lpd是脂酰胺脱氢酶(lipoamidedehydrogenase)、pura是腺苷酸琥珀酸合成酶(adenylosuccinatesynthetase)、sucb是二氢脂酰转琥珀酰酶(dihydrolipoyltranssuccinylase)、ubie是双功能2-辛烷基-6-甲氧基-1,4-苯醌甲基化酶和s-腺苷甲硫氨酸：2-dmk甲基转移酶(bifunctional2-octaprenyl-6-methoxy-1,4-benzoquinonemethylaseands-adenosylmethionine:2-dmkmethyltransferase)、ubih是2-辛烷基-6-甲氧基苯酚羟化酶(2-octaprenyl-6-methoxyphenolhydroxylase)、ygap是硫代硫酸盐硫转移酶(thiosulfatesulfurtransferase)。这些敲除子各自的生物膜形成能力较差，与枯草芽孢杆菌混合以后，可将枯草芽孢杆菌生物被膜形成能力降低82％-99％。

本发明所提到的上述大肠杆菌bw25113敲除子，全部来自于大肠杆菌bw25113keio单基因突变体文库，无需自己通过基因操作获得，可以通过商业渠道购买得到，然后，进行简单的实验室活化和复壮，即可使用，简单高效。

本发明所述的方法不涉及复杂的基因操作，只要具有基本的微生物学知识，就可以使用，易于在实际生产中推广使用。

本发明所用的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa、δatpb、δatpc、δatpd、δatph、δdcua、δguaa、δlpd、δpura、δsucb、δubie、δubih、δygap，可以从网址：https://horizondiscovery.com/en/products/gene-modulation/overexpression-reagents/non-mammalian/pifs/e-coli-keio-knockouts上购买得到；上述的敲除子本申请人也持有，保证自本发明的申请日起20年内向公众提供。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌浮游菌和大肠杆菌敲除子混合(a)以及敲除子本身的生物膜(b)形成量；注：柱子上方的数字为均值。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

从-80℃冰箱取出枯草芽孢杆菌py79野生菌株和大肠杆菌bw25113敲除子δatpa甘油种，待菌种融化后，各吸取10μl菌液分别转接入5ml新鲜无菌的lb液体培养基中，放置到摇床中过夜培养，第二天分别将枯草芽孢杆菌py79和大肠杆菌bw25113敲除子δatpa的过夜培养液用lb液体培养基调节菌液浓度至od600＝1.0的菌悬液母液备用；在无菌的一次性96孔板(corning)各孔中分别加入130μllb液体培养基，然后，在不同列的孔中分别加入上述od600＝1.0的枯草芽孢杆菌py79菌悬液母液(10μl)和od600＝1.0的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa菌悬液母液(10μl)，充分混合后，放入25℃恒温培养箱培养48h；并在同一个96孔板上分别以大肠杆菌bw25113敲除子δatpa(140μllb液体培养基+10μlod600＝1.0的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa菌悬液母液)、不加任何敲除子的枯草芽孢杆菌py79(140μllb液体培养基+10μlod600＝1.0的枯草芽孢杆菌py79菌悬液母液)作为对照。最后，将96孔板中的浮游菌轻轻的吸去弃除，然后，用无菌去离子水清洗板孔3次，将96孔板放置在室温下晾干，然后在每个板孔内加入200μl1％结晶紫染色液，静置室温染色45min，吸去结晶紫染色液，用无菌水洗板孔三次以去除多余的结晶紫，室温干燥30min后，200μl95％的乙醇脱色30min，利用全波长酶标仪测其在595nm处的吸光度值(od595)，作为生物被膜形成量即生物量的指标，以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δatpa的生物被膜形成量od595＝0.0567，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0489。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δatpa的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δatpa的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了94.83％(图1)。

实施例2：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δatpb，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δatpb的生物被膜形成量od595＝0.0144，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0298。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δatpb的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δatpb的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了96.84％(图1)。

实施例3：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δatpc，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δatpc的生物被膜形成量od595＝0.0106，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0697。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δatpc的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δatpc的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了92.62％(图1)。

实施例4：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δatpd，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δatpd的生物被膜形成量od595＝0.0513，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0576。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δatpd的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δatpd的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了93.90％(图1)。

实施例5：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δatph，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δatph的生物被膜形成量od595＝0.0254，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0862。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δatph的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δatph的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了90.87％(图1)。

实施例6：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δdcua，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δdcua的生物被膜形成量od595＝0.0241，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0082。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δdcua的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δdcua的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了99.14％(图1)。

实施例7：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δguaa，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δguaa的生物被膜形成量od595＝0.0078，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0209。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δguaa的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δguaa的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了97.79％(图1)。

实施例8：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δlpd，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δlpd的生物被膜形成量od595＝0.0195，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0898。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δlpd的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δlpd的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了90.49％(图1)。

实施例9：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δpura，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δpura的生物被膜形成量od595＝0.0093，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0384。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δpura的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δpura的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了95.94％(图1)。

实施例10：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δsucb，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δsucb的生物被膜形成量od595＝0.0908，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0800。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δsucb的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δsucb的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了91.53％(图1)。

实施例11：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δubie，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δubie的生物被膜形成量od595＝0.1410，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.1710。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δubie的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δubie的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了81.89％(图1)。

实施例12：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δubih，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δubih的生物被膜形成量od595＝0.0231，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0511。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δubih的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δubih的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了94.59％(图1)。

实施例13：

将实施例1中的大肠杆菌bw25113敲除子δatpa替换为大肠杆菌bw25113敲除子δygap，使用同实施例1中相同的方法(菌株转接复壮培养、菌液稀释、菌液混合比例、生物被膜培养和处理、结晶紫染色程序和od595测定方法)进行处理和测定。以上实验每个处理均设8个重复。

结果发现，大肠杆菌bw25113敲除子δygap的生物被膜形成量od595＝0.0311，枯草芽孢杆菌py79的od595＝0.9440，而当把它们混合以后，发现枯草芽孢杆菌py79的生物被膜形成量od595＝0.0221。由此可见，与未加入大肠杆菌bw25113敲除子δygap的对照相比，加入了大肠杆菌bw25113敲除子δygap的枯草芽孢杆菌py79生物被膜形成量降低了97.66％(图1)。