一种分泌抗Tau或pTau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种分泌抗tau或ptau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

阿尔兹海默症（alzheimer'sdisease，ad）是一种神经系统退行性疾病，伴有特殊病理和生理变化，是一种获得性、持续性及全面性的认知功能障碍的临床综合症。目前ad的诊断仍依赖于检测量表、mci、ct等传统手段，这就会出现诊断不及时等情况。

研究表明，tau蛋白是神经元细胞中众多微管相关蛋白（maps）之一，是一种低分子量含磷糖蛋白，它可以与神经轴突内的微管结合，并且具有诱导与促进微管蛋白聚合成微管、防止微管解聚和维持微管功能的稳定的作用。当tau蛋白发生高度磷酸化、异常糖基化、异常糖化以及泛素蛋白化时，tau蛋白失去对微管的稳定作用，导致神经纤维退化，从而引起神经功能失调。ad早期神经元纤维缠结（nft）病理改变较轻，以tau蛋白糖基化为主，而磷酸化tau蛋白含量较低，随着ad加重，以tau蛋白的过度磷酸化为主，因此，ad患者的磷酸化tau蛋白的含量会显著升高。

目前tau蛋白thr181位点、thr231位点及ser396磷酸化作为阿尔茨海默症诊疗靶点已有报道，但tau蛋白thr181位点、thr231位点及ser396位点磷酸化诊断用单克隆抗体还处于空白。

因此，亟需一种分泌抗tau或ptau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种分泌抗tau或ptau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，本发明提供特异性识别tau蛋白及thr181磷酸化位点、thr231磷酸化位点及ser396磷酸化位点的单克隆抗体及其制备方法，用于以tau-181/231/396磷酸化蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用，如阿尔茨海默病诊断及治疗。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明的第一目的提供一种分泌抗tau单克隆抗体杂交瘤细胞株3b6，所述杂交瘤细胞株3b6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:c202056。

本发明的第二目的提供一种分泌抗ptau-181单克隆抗体杂交瘤细胞株2a7，所述杂交瘤细胞株2a7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:c202057。

本发明的第三目的提供一种分泌抗ptau-231单克隆抗体杂交瘤细胞株3g8，所述杂交瘤细胞株3g8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:c202058。

本发明的第四目的提供一种分泌抗ptau-396单克隆抗体杂交瘤细胞株1f4，所述杂交瘤细胞株1f4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:c202059。

本发明的第五目的提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株分泌而成。

作为优选，所述单克隆抗体由所述杂交瘤细胞株3b6分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别microtubule-associatedproteintau蛋白，该蛋白序列如下：

ddkkakgadgktkiatprgaappgqkgqanatripaktppapktppssgeppksgdrsgysspgspgtpgsrsrtpslptpptrepkkvavvrtppkspssaksrlqtapvpmpdlknvkskigstenlkhqpgggkvqiinkkldlsnvqskcgskdnikhvpgggsvqivykpvdlskvtskcgslgnihhkpgggqvevksekldfkd，其序列如seqidno:1所示。

本发明的第六目的提供一种含有上述单克隆抗体的试剂盒。

作为优选，所述试剂盒包括捕获抗体标记的磁微粒、校准品、洗液、酶标记的检测抗体、发光底物。

本发明的第七目的提供一种单克隆抗体在制备用于检测ptau-181/231/396磷酸化蛋白的试剂中的应用。

作为优选，检测ptau-181磷酸化蛋白的试剂为检测ptau-181磷酸化蛋白含量增加或诊断以ptau-181磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂；检测ptau-231磷酸化蛋白的试剂为检测ptau-231磷酸化蛋白含量增加或诊断以ptau-231磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂；检测ptau-396磷酸化蛋白的试剂为检测ptau-396磷酸化蛋白含量增加或诊断以ptau-396磷酸化蛋白异常表达为表征的试剂。

作为优选，检测ptau-181磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3b6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株2a7分泌的单克隆抗体；检测ptau-231磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3b6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株3g8分泌的单克隆抗体；检测ptau-396磷酸化蛋白的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株3b6分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株1f4分泌的单克隆抗体。

本发明的有益效果是：本发明通过获得分泌抗tau蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，及ptau-181/231/396磷酸化蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得高特异性及高亲和力的针对tau蛋白及ptau-181/231/396磷酸化蛋白的单克隆抗体，可通过配对检测血液及脑脊液中的ptau-181/231/396磷酸化蛋白的含量，应用于制备检测ptau-181/231/396磷酸化蛋白含量变化或诊断以ptau-181/231/396磷酸化蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

细胞保藏：

本发明提供的杂交瘤细胞株3b6是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为cctccno:c202056，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明提供的杂交瘤细胞株2a7是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为cctccno:c202057，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明提供的杂交瘤细胞株3g8是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为cctccno:c202058，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明提供的杂交瘤细胞株1f4是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏日期为2020年4月3日，保藏号为cctccno:c202059，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

附图说明

图1是本发明实施例一中重组tau蛋白的鉴定示意图。

图2是本发明实施例五中1g7、2g2、3b6、4b2、4f7和4d8抗体sds-page电泳结果示意图。

图3是本发明实施例六中1e2、2a7和5g8抗体sds-page电泳结果示意图。

图4是本发明实施例七中2d3、3g8和3a1抗体sds-page电泳结果示意图。

图5是本发明实施例八中1f4和2e7抗体sds-page电泳结果示意图。

图6是本发明实施例十二中3b6抗体识别tau蛋白的m段示意图。

图7是本发明实施例十三中ptau-181检测体系校准曲线示意图。

图8是本发明实施例十三中脑脊液检测结果的roc曲线统计示意图。

图9是本发明实施例十三中血清检测结果的roc曲线统计示意图。

图10是本发明实施例十四中ptau-231检测体系校准曲线示意图。

图11是本发明实施例十四中脑脊液检测结果的roc曲线统计示意图。

图12是本发明实施例十四中血清检测结果的roc曲线统计示意图。

图13是本发明实施例十五中ptau-396检测体系校准曲线示意图。

图14是本发明实施例十五中脑脊液检测结果的roc曲线统计示意图。

图15是本发明实施例十五中血清检测结果的roc曲线统计示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中tau单克隆抗体的制备方法为：1）重组人tau蛋白表达并纯化，即得免疫抗原；2）利用步骤1)抗原对动物进行免疫，制备筛选获得杂交瘤细胞，将获得的杂交瘤细胞株扩大培养，小鼠腹腔接种得到含有目的单克隆抗体的腹水；3）将步骤2)小鼠腹水单克隆抗体进行纯化和选择，即为人tau蛋白单克隆抗体。

本发明中抗ptau-181、231、396单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：1）181、231、396磷酸化多肽分别通过戊二醛与tau截短蛋白进行偶联，即得重组ptau-181、231、396磷酸化蛋白免疫抗原；2）利用步骤1)抗原对动物进行免疫，制备筛选获得杂交瘤细胞，将获得的杂交瘤细胞株扩大培养，小鼠腹腔接种得到含有目的单克隆抗体的腹水；3）将步骤2)小鼠腹水单克隆抗体进行纯化和选择，即为抗ptau-181、231、396单克隆抗体。所述181磷酸化多肽的氨基酸序列为aktppapkt（p）ppssgeppk，其序列如seqidno:2所示，所述181磷酸化多肽的苏氨酸t位点添加有磷酸基团。所述231磷酸化多肽的氨基酸序列pkkvavvrt(p)ppkspssak，其序列如seqidno:3所示，所述231磷酸化多肽的苏氨酸t位点添加有磷酸基团。所述396磷酸化多肽的氨基酸序列hgaeivyks(p)pvvsgdtsp，其序列如seqidno:4所示，所述396磷酸化多肽的丝氨酸s位点添加有磷酸基团。所述tau截短蛋白的序列如seqidno:8所示。

实施例一：分泌抗tau单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备。

免疫原制备：依据人tau序列(uniport:p10636)以及编码cds序列（序列2）信息设计引物，并加入酶切位点，引物序列设计为tau-f:cgcggatccatggcggcagcgatg(添加酶切位点bamhi)，其序列如seqidno:5所示，tau-r:cccaagcttctagtgcccatacttttggaatt(添加酶切位点hindiii)，其序列如seqidno:6所示。从脑组织中提取mrna，逆转录合成cdna，扩增全长327bp，bamhi与hindiii双酶切pcr产物与pet28a(+)质粒，琼脂糖凝胶胶回收并t4dna连接酶连接；随后转化感受态细胞dh5a，37℃孵箱培养过夜，挑取阳性克隆，提取质粒酶切并测序鉴定。挑选正确序列重组质粒pet28a-tau质粒和pet28a空载体转化感受态bl21(de3）细胞。pet28a(+)-tau重组质粒的n端含有6xhis标签，便于后续利用ni-nta进行亲和层析纯化，标签蛋白可以增加重组蛋白表达以及免疫原性。

重组tau蛋白表达：挑取测序正确的阳性克隆bl21菌株进行pet28a(+)-tau蛋白的小量诱导表达。对诱导表达的条件进行探索，使用bl21作为表达菌，最终选取0.5mmiptg在37℃条件下诱导4小时作为合适的诱导表达程序，在此条件下pet28a(+)-tau蛋白有最大量的表达，且蛋白表达以可溶形式存在于菌内。每300ml大量表达的bl21菌液离心后，重悬于1xpbs中，冰浴条件下250w功率超声150次（超声5s，间隔5s)破菌，离心(10000g，4℃，10min)，弃沉淀，上清液用0.45um滤器过滤。

重组tau蛋白纯化：重组蛋白利用his标签与ni-nta层析柱进行亲和层析纯化。nihitrap预装层析柱用平衡缓冲液（20mmtris，8murea,10mmb-me,5mm咪唑，500mmnacl,ph8.0）平衡10个柱体积，利用恒流泵1ml/min将含有pet28a(+)-tau蛋白的上清液加入到层析柱中，顺序用10个柱体积的平衡缓冲液以及含咪唑20mm的清洗缓冲液对层析柱进行清洗，经过探索在150mm咪唑浓度洗脱缓冲液中（20mmtris,8murea,10mmb-me,150mm咪唑，500mmnacl，ph8.0）的条件下，有高纯度的重组蛋白被洗脱下来。最后，在1lph8.020mmtris150mmnacl，10umcacl2溶液中透析12h。利用peg6000将透析后的溶液浓缩到合适的浓度，离心，弃沉淀，并将上清分装存于-80℃冰箱。

重组tau蛋白的鉴定：利用亲和层析纯化得到的蛋白，经sds-page电泳显示，目的条带的位置符合预期的大小，约为44kd，纯度达到90%以上（图1）。

杂交瘤细胞融合：利用上述制备的免疫原免疫小鼠，检测小鼠血清效价达到1:10000后用tau蛋白腹腔加强免疫(50μg/只)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50ml离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1ml预热50％peg-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清dmem培养基15ml，37℃水浴5min，然后补加无血清dmem培养基至40ml，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40ml预热hat培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μl，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞6株，分别为1g7、2g2、3b6、4b2、4f7和4d8。

实施例二：分泌抗ptau-181单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备。

免疫原制备：将一定量的tau截短蛋白和181磷酸化多肽溶解到100μl磷酸盐缓冲液（0.01mph=7.2），蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1l磷酸盐缓冲液（0.01mph=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05mph=8.0tris-hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。最后对重组ptau-181磷酸化蛋白进行浓度测定，按每只50ug的蛋白量免疫小鼠。

杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用重组ptau-181磷酸化蛋白腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50ml离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1ml预热50％peg-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清dmem培养基15ml，37℃水浴5min，然后补加无血清dmem培养基至40ml，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40ml预热hat培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μl，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞3株，分别为1e2、2a7和5g8。

实施例三：分泌抗ptau-231单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备。

免疫原制备：将一定量的tau截短蛋白和231磷酸化多肽溶解到100μl磷酸盐缓冲液（0.01mph=7.2），蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1l磷酸盐缓冲液（0.01mph=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05mph=8.0tris-hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。最后对重组ptau-231磷酸化蛋白进行浓度测定，按每只50ug的蛋白量免疫小鼠。

杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用重组ptau-231磷酸化蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50ml离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1ml预热50％peg-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清dmem培养基15ml，37℃水浴5min，然后补加无血清dmem培养基至40ml，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40ml预热hat培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μl，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞3株，分别为2d3、3g8和3a1。

实施例四：分泌抗ptau-396单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备。

蛋白制备：将一定量的tau截短蛋白和396磷酸化多肽溶解到100μl磷酸盐缓冲液（0.01mph=7.2），蛋白：多肽的摩尔比为1：5~10，混匀。在上述100μl混合液中，加入20μl2.5%戊二醛，室温反应2h。偶联反应结束后，将上述反应液放入1l磷酸盐缓冲液（0.01mph=7.2）中4℃透析过夜，每隔4小时，换液一次。换用0.05mph=8.0tris-hcl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。最后对重组ptau-396磷酸化蛋白进行浓度测定，按每只50ug的蛋白量免疫小鼠。

杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用重组ptau-396磷酸化蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50ml离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1ml预热50％peg-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清dmem培养基15ml，37℃水浴5min，然后补加无血清dmem培养基至40ml，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40ml预热hat培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μl，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞2株，分别为1f4和2e7。

实施例五：tau单克隆抗体制备、纯化及效价检测。

单抗腹水制备：10-12周balb/c小鼠腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5ml/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的6株杂交瘤细胞，约1-10⁶/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。

抗体纯化：收集的小鼠腹水用0.45μm的滤器过滤，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mmpbs溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1ml/min流速上样到proteina-sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mmpbs，ph7.0)清洗，然后用0.1m甘氨酸-盐酸溶液ph2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1mph9.0tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mmpbs溶液透析3次。将透析后的抗体进行sds-page电泳，结果显示，6株抗体在50kd与25kd处有条带，灰度分析纯度均大于90％，1g7、2g2、3b6、4b2、4f7和4d8抗体sds-page，见图2所示。

单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的tau蛋白的碳酸盐缓冲液(ph9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1:8000，1:16000，1：32000，1：64000、1:128000、1：256000、1：512000)，加入羊抗鼠igg-hrp(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(s/n>2.1)，1g7、2g2、3b6、4b2、4f7和4d8单克隆抗体效价分别为1：128000，1:256000，1：256000，1：512000，1:64000，1:128000。

实施例六：ptau-181单克隆抗体制备、纯化及效价检测。

单抗腹水制备：10-12周balb/c腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5ml/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的3株杂交瘤细胞，约1-10⁶/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。

抗体纯化：收集的小鼠腹水用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mmpbs溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1ml/min流速上样到proteina-sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mmpbs，ph7.0)清洗，然后用0.1m甘氨酸-盐酸溶液ph2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1mph9.0tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mmpbs溶液透析3次。将透析后的抗体进行sds-page电泳，结果显示，3种抗体在50kd与25kd处有条带，灰度分析纯度均大于90％，1e2、2a7和5g8抗体sds-page，见图3所示。

单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的重组ptau-181磷酸化蛋白的碳酸盐缓冲液(ph9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1:8000，1:16000，1：32000，1：64000、1:128000、1：256000、1：512000)，加入羊抗鼠igg-hrp(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(s/n>2.1)，1e2、2a7和5g8单克隆抗体效价均为1：64000，1：128000，1：64000。

实施例七：ptau-231单克隆抗体制备、纯化及效价检测。

单抗腹水制备：10-12周balb/c小鼠腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5ml/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的3株杂交瘤细胞，约1-10⁶/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。

抗体纯化：收集的小鼠腹水用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mmpbs溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1ml/min流速上样到proteina-sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mmpbs，ph7.0)清洗，然后用0.1m甘氨酸-盐酸溶液ph2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1mph9.0tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mmpbs溶液透析3次。将透析后的抗体进行sds-page电泳，结果显示，3种抗体在50kd与25kd处有条带，灰度分析纯度均大于90％，2d3、3g8和3a1抗体sds-page，见图4所示。

单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的重组ptau-231磷酸化蛋白的碳酸盐缓冲液(ph9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1:8000，1:16000，1：32000，1：64000、1:128000、1：256000、1：512000)，加入羊抗鼠igg-hrp(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(s/n>2.1)，2d3、3g8和3a1单克隆抗体效价分别为1：128000，1：64000，1：64000。

实施例八：ptau-396单克隆抗体制备、纯化及效价检测。

单抗腹水制备：10-12周balb/c小鼠腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5ml/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的2株杂交瘤细胞，约1-10⁶/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。

抗体纯化：收集的小鼠腹水用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mmpbs溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1ml/min流速上样到proteina-sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mmpbs，ph7.0)清洗，然后用0.1m甘氨酸-盐酸溶液ph2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1mph9.0tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mmpbs溶液透析3次。将透析后的抗体进行sds-page电泳，结果显示，2种抗体在50kd与25kd处有条带，灰度分析纯度均大于90％，1f4和2e7抗体sds-page，见图5所示。

单克隆抗体效价检测：以5μg/ml的重组ptau-396磷酸化蛋白的碳酸盐缓冲液(ph9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1:8000，1:16000，1：32000，1：64000、1:128000，、1：256000、1：512000)，加入羊抗鼠igg-hrp(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(s/n>2.1)，1f4和2e7单克隆抗体效价均为1：256000，1：128000。

实施例九：ptau-181单克隆抗体配对验证。

将tau单克隆抗体1g7、2g2、3b6、4b2、4f7和4d8分别以5μg/ml的浓度包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(0-160mg/ml)的重组ptau-181磷酸化蛋白，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μl浓度为100ng/ml的hpr标记的ptau-181单克隆抗体1e2、2a7和5g8，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表1所示。从结果上看，tau单克隆抗体3b6与ptau-181单克隆抗体2a7配对更佳，灵敏度和吸光度更高。

表1：ptau-181单克隆抗体配对结果。

实施例十：ptau-231单克隆抗体配对验证。

将tau单克隆抗体1g7、2g2、3b6、4b2、4f7和4d8分别以5μg/ml的浓度包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(0-160mg/ml)的重组ptau-231磷酸化蛋白，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μl浓度为100ng/ml的hpr标记的ptau-231单克隆抗体2d3、3g8和3a1，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表2所示。从结果上看，tau单克隆抗体3b6与ptau-231单克隆抗体3g8配对更佳，灵敏度和吸光度更高。

表2：ptau-231单克隆抗体配对结果。

实施例十一：ptau-396单克隆抗体配对验证。

将tau单克隆抗体1g7、2g2、3b6、4b2、4f7和4d8分别以5μg/ml的浓度包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(0-160mg/ml)的重组ptau-396磷酸化蛋白，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μl浓度为100ng/ml的hpr标记的ptau-396单克隆抗体1f4和2e7，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表3所示。从结果上看，tau单克隆抗体3b6与ptau-396单克隆抗体1f4配对更佳，灵敏度和吸光度更高。

表3：ptau-396单克隆抗体配对结果。

实施例十二：tau单克隆抗体表位鉴定。

重组截断tau蛋白构建表达：根据tau蛋白氨基酸序列，设计了n、m、c端的序列以及tau全长蛋白，连接至表达载体pet28a，并装入表达菌株bl21(de3)中。在lb培养基中，iptg1mmol/l37度条件下过夜诱导tau截断重组蛋白可溶性表达。原核重组表达经6×his标签亲和纯化，纯化后的蛋白进行sds-page电泳，纯度均在90%以上。

tau-n片段，其序列如seqidno:7所示：

maeprqefevmedhagtyglgdrkdqggytmhqdqegdtdaglkesplqtptedgseepgsetsdakstptaedvtaplvdegapgkqaaaqphteipegttaeeagigdtpsledeaaghvtqarmvskskdgtgsddkkakgadgktkiatprgaappgqkgqanatripaktp。

tau-m片段，其序列如seqidno:8所示：

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tau-c片段，其序列如seqidno:9所示：

kskigstenlkhqpgggkvqiinkkldlsnvqskcgskdnikhvpgggsvqivykpvdlskvtskcgslgnihhkpgggqvevksekldfkdrvqskigsldnithvpgggnkkiethkltfrenakaktdhgaeivykspvvsgdtsprhlsnvsstgsidmvdspqlatladevsaslakqgl。

tau全长，其序列如seqidno:10所示：

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蛋白免疫印迹法wb确认抗体识别表位：重组蛋白tau-n、m、c和tau全长4种蛋白取5μg上样，进行15％sds-page电泳。电泳完成后，150v恒压条件下，蛋白转入0.45pgmpvdf。转膜完成后利用含5％bsa的pbst溶液37℃封闭两小时。用5μg/ml的3b6单克隆抗体溶液37℃孵育1小时。孵育完成后，加入50ng/ml的羊抗鼠igg-hrp孵育1小时。清洗完成后，加入dab显色液进行显色。tau全长蛋白作为阳性对照，tau-n/m/c片段位置棕色沉淀物质，则表明抗体识别该目的片段。结果显示，3b6抗体识别tau蛋白的m段，见图6。

实施例十三：ptau-181磷酸化蛋白的检测体系构建。

校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体3b6，浓度为5μg/ml，将重组ptau-181磷酸化蛋白用10％bsa溶液稀释为0pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml、160pg/ml，每孔100μl，再加入碱性磷酸酶标记的2a7抗体，浓度100ng/ml，每孔100μl，37℃孵育30min。用pbst清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的ptau-181含量。校准曲线线性范围0～160pg/ml，图7为ptau-181检测体系校准曲线，其中，y轴代表rul值（发光值），x轴代表ptau-181校准品的浓度。

ptau-181检测试剂盒用于阿尔兹海默症诊断:检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非ad患者脑脊液和血清。使用ptau-181检测体系检测阿尔兹海默症、非ad患者脑脊液中ptau-181浓度，roc曲线（图8）统计结果显示，曲线下面积为0.943，以45pg/ml作为检测参考值，ptau-181检测试剂盒特异性为93.33％（28/30），灵敏度为86.67％（26/30）。检测阿尔兹海默症、非ad患者血清中ptau-181浓度，roc曲线（图9）统计结果显示，曲线下面积为0.894，以35pg/ml作为检测参考值，ptau-181检测试剂盒特异性为86.67％（26/30），灵敏度为83.33％（25/30）。

实施例十四：ptau-231磷酸化蛋白的检测体系构建。

校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体3b6，浓度为5μg/ml，将重组ptau-231磷酸化蛋白用10％bsa溶液稀释为0pg/ml、12.5pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml，每孔100μl，再加入碱性磷酸酶标记的3g8抗体，浓度50ng/ml，每孔100μl，37℃孵育30min。用pbst清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的ptau-231含量。校准曲线线性范围0～200pg/ml，图10为ptau-231检测体系校准曲线，其中，y轴代表rul值（发光值），x轴代表ptau-231校准品的浓度。

ptau-231检测试剂盒用于阿尔兹海默症诊断:检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非ad患者脑脊液和血清。使用ptau-231检测体系检测阿尔兹海默症、非ad患者脑脊液中ptau-231浓度，roc曲线（图11）统计结果显示，曲线下面积为0.91，以51pg/ml作为检测参考值，ptau-231检测试剂盒特异性为96.67％（29/30），灵敏度为90％（27/30）。检测阿尔兹海默症、非ad患者血清中ptau-231浓度，roc曲线（图12）统计结果显示，曲线下面积为0.853，以42pg/ml作为检测参考值，ptau-231检测试剂盒特异性为90％（27/30），灵敏度为80％（24/30）。

实施例十五：ptau-396磷酸化蛋白的检测体系构建。

校准曲线绘制：首先在固相载体如磁微粒上包被捕获抗体3b6，浓度为5μg/ml，将重组ptau-396磷酸化蛋白用10％bsa溶液稀释为0pg/ml、15pg/ml、30pg/ml、60pg/ml、120pg/ml、240pg/ml，每孔100μl，再加入碱性磷酸酶标记的1f4抗体，浓度400ng/ml，每孔100μl，37℃孵育30min。用pbst清洗3次，化学发光底物加入后，检测发光值。从校准曲线计算出被测样品的ptau-396含量。校准曲线线性范围0～240pg/ml，图13为ptau-396检测体系校准曲线，其中，y轴代表rul值（发光值），x轴代表ptau-396校准品的浓度。

ptau-396检测试剂盒用于阿尔兹海默症诊断:检测30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时检测30例非ad患者脑脊液和血清。使用ptau-396检测体系检测阿尔兹海默症、非ad患者脑脊液中ptau-396浓度，roc曲线（图14）统计结果显示，曲线下面积为0.896，以64pg/ml作为检测参考值，ptau-396检测试剂盒特异性为93.33％（28/30），灵敏度为83.33％（25/30）。检测阿尔兹海默症、非ad患者血清中ptau-396浓度，roc曲线（图15）统计结果显示，曲线下面积为0.835，以42pg/ml作为检测参考值，ptau-396检测试剂盒特异性为80％（24/30），灵敏度为83.33％（25/30）。

综上所述，本发明提供的单克隆抗体可用于样品中ptau-181/231/396蛋白的检测，且特异性强、灵敏度高。4株单克隆抗体特异识别tau蛋白的不同表位，可通过配对检测脑脊液和血清中ptau-181/231/396含量，应用于检测ptau-181/231/396蛋白过量表达或诊断以ptau-181/231/396蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州仁端生物医药科技有限公司

<120>一种分泌抗tau或ptau-181/231/396单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

<160>10

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