一种T7核酸内切酶I的制备方法与流程

本申请是中国国家申请号201410141111.4，发明名称为“一种t7核酸内切酶i的制备方法”的分案申请。

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸内切酶的制备方法。

背景技术：

t7核酸内切酶i是一种多功能核酸酶，可特异识别并拆分重组中间体(holidayjunction，hj)交叉结构，随机切刻双链dna，特异识别并切割双链dna中的切刻和单碱基错配位点。

该酶蛋白是t7噬菌体基因3编码产物，由包含149个氨基酸残基的多肽链构成，两条肽链通过结构域交换形成同源二聚体，其催化中心由来自两个亚基的氨基酸侧链共同组成，两个催化结构域可以独立作为dna切刻酶；通过结构域之间的协同作用，表现出结构特异性催化。作为一种已知的噬菌体类解离酶，该酶可以剪切分叉dna，随机切刻线性dna，识别并切刻nicked-dna位点，识别单碱基错配位点，t7核酸内切酶i对hj的结合具有高度特异性，其结合hj的能力是结合线性双链dna的1000倍左右，还具备随机在双链dna中引入切刻位点的活性，专一性识别切刻位点并在另一条dna链上对应位置引入另一切刻位点导致dna双链的断裂，专一性识别并切割dna双链中的单碱基错配位点。该酶应用广泛，具有作为工具酶的重要价值。主要的商业用途包括：可用于分支dna结构的解离，基因组测序技术和dna-shuffling技术中dna的前处理，snp的检测等。

目前制备t7核酸内切酶的方法是：将蛋白分别表达合成出两段肽链，在体外融合而成。采用impact-twin蛋白纯化系统纯化与mbp融合表达的截短型无活性t7核酸内切酶i(tt7endoi)，该融合蛋白的c-端带有硫酯键。然后体外合成一段合成肽，其中含有被前者截下来的氨基酸，将该合成肽与融合蛋白的c-端硫酯键相连接，形成全长具有活性的t7核酸内切酶i。最后，再用因子xa将mbp融合头切去，纯化得到全长的野生型t7核酸内切酶i。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种核酸内切酶的制备方法，该方法操作简便、易于规模化生产，并能有效节约成本。

本发明所述的一种t7核酸内切酶的制备方法，包括以下步骤：

(a)t7核酸内切酶的表达载体的构建；

(b)将不含有终止密码子的编码序列插入到步骤a所获得的蛋白表达载体中；以及

(c)采用与标签相适应的纯化方法，获得目标蛋白质即t7核酸内切酶。

根据本发明所述的t7核酸内切酶的制备方法的进一步特征，所述表达载体包括：用于插入目的蛋白即t7核酸内切酶的编码序列的识别和切割位点；在所述识别和切割位点的上游具有如seqidno：1所示的giiis信号肽编码序列，其前面是起始密码子；在所述识别和切割位点的下游具有his6标签，其后面是终止密码子。

优选地，所述的识别和切割位点为bsai识别及切割位点。

本发明的优点在于：构建n端带m13噬菌体蛋白iii的前导序列(giiis)的载体，合成出来的信号肽能引导蛋白分泌出核外，在细胞周质中表达，对细胞本身的基因组无毒性，故能直接在体内表达出可溶并有生物活性的t7核酸内切酶i。这种生产方法简便易操作，易于规模化生产，并能有效节约成本。

经实验表明，本发明所述方法获得的t7核酸内切酶i能特异地识别dna片段中不匹配的位点，并在这此位点附近进行切割。其切割效率与商品化的t7核酸内切酶i相当，活性良好。相比于现有技术，本发明所述方法操作更为简便、易于规模化生产，并能有效节约成本。

附图说明

图1是t7核酸内切酶i的ni柱层析电泳图；图中，s：层析前样品；x：穿过样品；elution：线性洗脱收集峰。

图2是t7核酸内切酶i的heparin柱层析电泳图；图中，s：层析前样品；x：穿过样品；elution：线性洗脱收集峰。

图3是t7核酸内切酶i的hitrapspp柱层析电泳图；图中，s：层析前样品；x：穿过样品；elution：线性洗脱收集峰。

图4是反应产物用于琼脂糖凝胶电泳图；图中，m：100-3000bpdnamarker；1：加入nebt7核酸内切酶i(nebcatalog#m0302)的阳性对照；2：加入纯化后的t7核酸内切酶i；3：不加任何酶，加入ddh2o作为阴性对照；圆点：t7核酸内切酶i识别后切开所形成的条带，长度分别在480bp及330bp左右。

具体实施方式

以下合通过具体实施例结合附图的方式对本发明做进一步说明，目的在于本发明的内容而非限制发明的保护范围。下面实施例中，除非特别注明试验方法的具体条件，通常按照常规条件，如sambrook等人著的《分子克隆：试验指南》(newyork，coldspringhabourlaboratorypress)中所述条件，或按照制造厂商建议条件进行。实验所需菌种、质粒、试剂等均为商品化产品，均可通过生物制品厂商购买获得。

实施例1：t7核酸内切酶i的制备

制备方法：将t7基因的编码序列构建表达克隆，于大肠杆菌中表达，重组蛋白经过层析纯化后，获得目标蛋白。

具体流程如下：

(1)构建带bsai酶切位点的pet28-giiis表达载体

在pet28表达载体xhoi酶切位点上游加入一个bsai识别及切割位点(5’-ggtctct/aggt-3’)，并在bsai位点的上游加上起始密码子atg和giiis信号肽编码序列，信号肽氨基酸序列如seqidno：1所示。

seqidno：1kkllfaiplvvpfyshs

(2)构建含基因片段的表达克隆

设计含有bsai酶切位点的上游引物(seqidno：2)和xhoi(seqidno.3)酶切位点的下游引物，从大肠杆菌t7噬菌体基因组中进行pcr扩增，获得459bp含有t7核酸内切酶i基因编码序列的插入片段，其开放阅读框中不含有终止密码子。用bsai和xhoi两个内切酶对片段及载体进行酶切，酶切之后的片段与载体含有相同的粘性末端。

seqidno：25’-atatatggtctcgtagcatggcaggttacggcgct-3’

seqidno.35’-atatatctcgagtttctttcctcctttcctttttaa-3’

用t4dna连接酶连接插入片段和pet28载体。插入片段开放阅读框的下游包含有一个his6标签，以用于下游ni柱纯化。his6标签后含有一个终止密码子tga。连接产物进行转化到e.coli2t1感受态，在lb培养基上37℃过夜培养。通过鉴定后筛选出正确的转化子在lb液体培养基中扩大培养。

(3)收集菌液，细胞沉淀悬浮缓冲液a(20mmtris、50mmnacl、2.5％甘油，ph7.0)和2xotg等体积混合的溶液中，然后以大约18000psig通过高压破碎机，裂解物于12000rmp离心40min后收集上清。上清按1000∶1的比例加入polyethylenimine充分混匀30分钟，12000rmp离心40分钟收集上清过0.22μm滤膜。

(4)将上清加到已用缓冲液a平衡好的histrap-ni柱上。用缓冲液a冲平基线，然后用0-500mm的imidazole线性梯度洗脱收集。对各收集组份进行sds-page检测(图1)，收集含目的蛋白的组份。

(5)含目的蛋白的组份被汇集到一起，将样品上样到已经平衡好的heparin柱子上。用缓冲液a冲平基线，然后用0-1m的nacl线性洗脱。对各收集组份进行sds-page检测(图2)，收集含目的蛋白的组份。

(6)将上述各组份汇集到一起透析到缓冲液a后，样品上样到已用缓冲液a平衡好的hitrapspp柱子上。用缓冲液a冲平基线，然后用0-1m的nacl线性洗脱。对各收集组份进行sds-page检测(图3)，收集含目的蛋白的组份。

(7)将上述各组份汇集到一起透析到贮存缓冲液(200mmnacl、20mmtris-hclph7.5、0.01mmedta、1mmdtt、0.15％tritonx-100、50％glycerin)。纯化后的酶在-20℃保存。

实施例2：t7核酸内切酶i的活性检测

设计两个含有10个碱基差异的克隆，取相同的上游和下游引物进行扩增，得到一对有10个碱基不匹配的pcr产物。序列见seqidno：4及seqidno：5。

将两种pcr产物等量混合，在含有1x缓冲液(50mmnacl，10mmtris-hcl，10mmmgcl21mmdtt，ph7.9@25℃)中95℃变性5min，再退火至室温，形成具有一个重组中间体(hj)的产物。在上述退火体系中加入1u实施例1所制备的t7核酸内切酶i，37℃孵育1小时。以nebt7核酸内切酶i(catalog#m0302)为阳性对照(pc)，并设置不加酶的阴性对照(nc)。反应结束后加入含有sds的上样缓冲液终止反应。反应产物用于琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。

结果分析表明：本发明所述方法得到的t7核酸内切酶i能特异地识别dna片段中不匹配的位点，并在这此位点附近进行切割。其切割效率与商品化的t7核酸内切酶i相当，证明其活性保持良好。