一种用于耐高温微生物菌剂的固体载体配方及制备方法与流程

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种用于耐高温微生物菌剂的固体载体配方及制备方法。

背景技术：

微生物在地球生态系统物质循环中扮演着分解者的身份，能够降解或转化自然界中的各种物质，并且微生物独特的形态结构及生理代谢，对污染物的降解转换、各类资源的循环再利用以及生态环境保护等方面都有着巨大的潜力。微生物菌剂在废水处理、发酵工业、固体堆肥发酵、有机废弃物处理等方面有着广泛的用途。微生物菌剂主要有液体菌剂和固体菌剂，液体发酵技术生产液态微生物菌剂具有自动化程度高，培养周期短、生产效率高、微生物活性高等优点，但也存在运输不方便、保藏时间短等缺点。相比液体菌剂，固体菌剂具有储藏、运输方便，稳定性好，保藏周期长等优点。

通过固定化微生物技术获得的固定化微生物菌剂具有微生物活性高、单位空间微生物密度高、作用效果良好，作用效果持久等优点。微生物固化方法包括包埋法，交联法和吸附法，吸附法是一种廉价、有效的微生物固定化方法，是通过利用载体的多孔性、比表面积大等特点来吸附菌体发酵液，从而制成活菌制剂。

微生物菌剂在我国的应用还不算十分广泛，在科研和应用之间的对接并不顺利，很多市场上的微生物菌剂产品达不到国家的标准，目前微生物菌剂存在活菌易失活、运输和保存不方便的情况，其中很大一部分原因归咎于微生物菌剂载体的选择。科研人员通过电镜扫描不同载体对微生物的吸附实验，验证了载体是影响菌剂质量的重要因素，当下微生物菌剂的载体主要包括有机载体和无机载体，如蛭石、草炭、沸石、硅藻土、菌糠、玉米粉、豆粕、麸皮等，不同的载体，性能不一，根据不同的菌剂，吸附效果不同。不同种类的载体及其配比对微生物的吸附不同，因此筛选出菌落数最高，且价廉易得的复合载体配方至关重要。现有技术中，大多采用单一的载体来吸附菌剂，其吸附相关一般。

技术实现要素：

发明目的：为了克服背景技术的不足，本发明第一目的是公开一种用于耐高温微生物菌剂的固体载体；第二目的是公开该固体载体的制备方法；第三目的是公开利用该固体载体制备耐高温微生物菌剂的方法。

技术方案：本发明的用于耐高温微生物菌剂的固体载体，主要由以下质量份数的原料组成：

1份的硅藻土、0.5-1份的麦饭石和0.5-1份的麸皮。

进一步的，所述硅藻土、麦饭石和麸皮的粉碎度≧50目。

进一步的，所述硅藻土、麦饭石和麸皮的含水率≦10％。

上述用于耐高温微生物菌剂的固体载体的制备方法，包括以下步骤：

s1、将硅藻土，麦饭石及麸皮进行粉碎，最小过50目筛；

s2、分别放置鼓风干燥箱中干燥，使含水率≦10％；

s3、再以1：0.5-1：0.5-1的质量比例称取硅藻土、麦饭石和麸皮，放置干燥的搅拌机中，经正、反交替转动，混合得到固体载体。

一种利用上述固体载体制备耐高温微生物菌剂的方法，包括以下步骤：

s1、菌种活化：

取lb肉汤、琼脂，中性ph下制备lb固体培养基，灭菌，提前将保存于-20℃～-80℃低温中的菌种保存管取出，待结冰完全溶解，在无菌超净台中用平板划线法将菌种接种至lb固体培养基，在37-60℃条件下培养20-25h，即得到活化菌种，备用；

s2、发酵培养：

取lb肉汤制备液体培养基，中性ph，灭菌冷却后，将活化菌种接种至液体培养基中，在150-200r/min、37-60℃摇床中培养1-3d，得发酵液，备用；

s3、载体制备：

取质量份为1份的硅藻土、0.5-1份的麦饭石和0.5-1份的麸皮，使粉碎度≧50目，含水率≦10％，混合得载体，备用；

s4、菌剂制备：

将s2中得到的发酵液与s3中得到的载体以1ml：(0.5-1)g的比例混匀，放置干燥的搅拌机中，正反交替转动混合，最后放置于37-60℃鼓风干燥箱中烘干至恒重。

其中，s4中的混合方法为铺一层载体，均匀喷洒一层发酵液，并交替施工。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点为：本发明选择将无机载体和有机载体进行混合，不仅使得载体拥有较强的吸附能力，能够在短时间内更多的吸附微生物，尽快的达到吸附平衡，还可以为微生物提供充足的营养物质，弥补后期营养物质不足导致的菌落损失；同时，还能为微生物提供疏松透气的生长环境，防止自身被降解而导致的损失，可以延长微生物菌剂的保藏时间；通过本发明的载体制备成的耐高温微生物菌剂中的活菌数远超执行标准，同时还具备更长的保质期。

附图说明

图1是本发明制备的菌剂不同分辨率下产品图；

图2是本发明制备的菌剂中菌落数随时间变化图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1

一种耐高温降油脂芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、菌种活化：lb肉汤20g/l，琼脂20g/l，ph为7，制备lb固体培养基，灭菌。提前将保存于-20℃℃低温冰箱中的芽孢杆菌wh-1保存管取出，待结冰完全溶解。在无菌超净台中用平板划线法将菌种接种至lb固体培养基，在50℃条件下培养24h，即得到活化菌种，备用。

s2、发酵培养：lb肉汤20g/l制备液体培养基，ph为7，灭菌冷却后，将活化好的接种至的100ml液体培养基中，在180r/min、50℃摇床中培养3d，备用。

s3、载体制备：将硅藻土，麦饭石及麸皮进行粉碎过50目筛，分别放置鼓风干燥箱中干燥，使含水率≦10％(实际为10％)，再以1：0.5：0.5的重量比例称取硅藻土、麦饭石和麸皮，放置干燥的搅拌机中，设置搅拌转速为60r/min，正转30min，反转30min，充分搅拌混合得到复合载体，备用。

硅藻土为白色，灰白色物质，密度为0.3-0.5g/cm3，空隙率达70％-90％，具有质轻，细腻，松散，多孔等特性，为微生物的生长提供了良好的环境，而且吸水性很强，ph呈中性，无毒，化学性质比较稳定，不溶于强酸。

麦饭石属火山岩类，对生物无毒无害，具有双重的吸附性：一方面是因为它以硅酸盐为主，具有很好的吸附性；另一方面由于它含有很多高岭石等黏土矿物，是多孔性海绵状特殊结构，有强烈的静电引力，因此对细菌具备极强的吸附性。

麸皮为淡黄色物质，是小麦加工面粉后的副产品，其作为有机载体可以在短时间内为细菌提供一定的营养物质，并且空隙度大，可以保持疏松透气，防止微生物自身被降解，且吸湿性强。

将无机载体和有机载体进行混合，因为载体的比表面积大小和吸附能力决定着其吸附微生物的数量和速率，孔径的大小影响着吸附质在孔内的扩散速率，而无机载体能够在短时间内更多的吸附微生物，且尽快的达到吸附平衡。为了弥补后期营养物质不足导致的菌落损失，加入有机载体，为微生物提供充足的营养物质，载体的通气性和吸水性也会影响微生物的存活，可以选择兼备支撑作用的物质作为载体，不仅能为微生物提供疏松透气的生长环境，防止自身被降解而导致的损失，同时可以延长微生物菌剂的保藏时间。

s4、菌剂制备：将s2中得到的发酵液与s3中得到的复合载体以1:1(ml：g)的比例充分混匀，混合方式为铺一层载体，均匀的喷洒一层菌液，再铺一层载体，在喷洒菌液，以此类推。再将菌剂放置干燥的搅拌机中，转速为40r/min，正转30min，反转30min，最后将菌剂放置于50℃鼓风干燥箱中烘干至恒重。

制备好的菌剂，如图1所示。

测定菌剂中的活菌数2.2*10⁹cfu/g，执行标准为参照gb20287——2006(表1)。

表1农用微生物菌剂标准

保质期测定：将菌剂保存于阴凉干燥处，避免阳光直射，并以10天为单位监测菌剂中的菌落数。如图2所示，菌剂在3个月内的菌落数损失率很低，而且菌落数仍高于农用微生物菌剂的标准。

含水率测定：利用烘干法测得菌剂产品的含水率≦5％。

实施例2

一种耐高温降蛋白芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、菌种活化：lb肉汤20g/l，琼脂25g/l，ph为7，制备lb固体培养基，灭菌。提前将保存于-80℃低温冰箱中的芽孢杆菌wh-2保存管取出，待结冰完全溶解。在无菌超净台中用平板划线法将菌种接种至lb固体培养基，在60℃条件下培养20h，即得到活化菌种，备用。

s2、发酵培养：lb肉汤20g/l制备液体培养基，ph为7，灭菌冷却后，将活化好的接种至的50ml液体培养基中，在150r/min、60℃摇床中培养1d，备用。

s3、载体制备：将硅藻土，麦饭石及麸皮进行粉碎过60目筛，分别放置鼓风干燥箱中干燥，使含水率≦10％(实际为8％)，再以1：1：1的重量比例称取硅藻土、麦饭石和麸皮，放置干燥的搅拌机中，设置搅拌转速为60r/min，正转30min，反转30min，充分搅拌混合得到复合载体，备用。

s4、菌剂制备：将s2中得到的发酵液与s3中得到的复合载体以1:0.5(ml：g)的比例充分混匀，混合方式为铺一层载体，均匀的喷洒一层菌液，再铺一层载体，在喷洒菌液，以此类推。再将菌剂放置干燥的搅拌机中，转速为40r/min，正转30min，反转30min，最后将菌剂放置于60℃鼓风干燥箱中烘干至恒重。

测定菌剂中的活菌数2.8*10⁹cfu/g。

保质期测定：将菌剂保存于阴凉干燥处，避免阳光直射，并以10天为单位监测菌剂中的菌落数。菌剂在3个月内的菌落数损失率很低，而且菌落数仍高于农用微生物菌剂的标准。

含水率测定：利用烘干法测得菌剂产品的含水率≦5％。

实施例3

一种耐高温降纤维素微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、菌种活化：lb肉汤20g/l，琼脂22g/l，ph为7，制备lb固体培养基，灭菌。提前将保存于-40℃低温冰箱中的芽孢杆菌wh-3保存管取出，待结冰完全溶解。在无菌超净台中用平板划线法将菌种接种至lb固体培养基，在37℃条件下培养25h，即得到活化菌种，备用。

s2、发酵培养：lb肉汤20g/l制备液体培养基，ph为7，灭菌冷却后，将活化好的接种至的80ml液体培养基中，在200r/min、37℃摇床中培养2d，备用。

s3、载体制备：将硅藻土，麦饭石及麸皮进行粉碎过80目筛，分别放置鼓风干燥箱中干燥，使含水率≦10％(实际为5％)，再以1：0.75：0.75的重量比例称取硅藻土、麦饭石和麸皮，放置干燥的搅拌机中，设置搅拌转速为60r/min，正转30min，反转30min，充分搅拌混合得到复合载体，备用。

s4、菌剂制备：将s2中得到的发酵液与s3中得到的复合载体以1:0.75(ml：g)的比例充分混匀，混合方式为铺一层载体，均匀的喷洒一层菌液，再铺一层载体，在喷洒菌液，以此类推。再将菌剂放置干燥的搅拌机中，转速为40r/min，正转30min，反转30min，最后将菌剂放置于37℃鼓风干燥箱中烘干至恒重。

测定菌剂中的活菌数2.5*10⁹cfu/g。

保质期测定：将菌剂保存于阴凉干燥处，避免阳光直射，并以10天为单位监测菌剂中的菌落数。菌剂在3个月内的菌落数损失率很低，而且菌落数仍高于农用微生物菌剂的标准。

含水率测定：利用烘干法测得菌剂产品的含水率≦5％。