一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质及其制备方法与流程

文档序号:22739373发布日期:2020-10-31 09:21阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质,其特征是,所述标准物质以病毒为载体,包裹新型冠状病毒核酸检测的靶标基因。

2.根据权利要求1所述的一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质,其特征是,所述靶标基因为orf1ab、n基因和e基因。

3.根据权利要求1或2所述的一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质,其特征是,所述病毒载体还包裹内参基因hrnasep基因。

4.一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质的制备方法,其特征是,包括:

合成靶标基因;

将靶标基因分别载入病毒质粒载体;

将病毒质粒转化入大肠杆菌进行培养;

分离、回收病毒质粒;

将病毒质粒转染hek293t细胞并进行病毒包装;

将包装好的病毒颗粒提纯、重悬后,加冻干保护剂分装,经真空冷冻干燥后封装。

5.根据权利要求4所述的一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质的制备方法,其特征是,所述靶标基因的合成方法为:

对新型冠状病毒的开放阅读框orf1ab基因、核衣壳n基因、包膜e基因和内参基因hrnasep基因序列进行修改,使其在5'端和3'端包含随机的终止密码子;

合成上述4种基因并做基因融合,合成4种融合基因片段,分别是orf1ab基因和hrnasep基因、e基因和hrnasep基因、n基因和hrnasep基因以及单独的hrnasep基因。

6.根据权利要求4所述的一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质的制备方法,其特征是,将靶标基因分别载入病毒质粒载体的方法为:采用genbuilder™克隆试剂盒,将靶标基因分别反向克隆到慢病毒质粒plenti-puro载体中的puromycin抗性基因上游的多克隆位点,同时替换慢病毒质粒载体上的cmv启动子。

7.根据权利要求4所述的一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质的制备方法,其特征是,将病毒质粒转化入大肠杆菌的方法为:将病毒质粒分别转化入大肠杆菌stbl3,在lb培养基37℃、14~16小时过夜培养。

8.根据权利要求4所述的一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质的制备方法,其特征是,分离、回收病毒质粒的方法为:用碱性裂解提取法分离质粒,经离子交换柱层析、te洗脱、质粒纯化后回收病毒质粒并去除内毒素。

9.根据权利要求4所述的一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质的制备方法,其特征是,将病毒质粒转染hek293t细胞及病毒包装的过程为:将病毒颗粒在培养皿中和表达病毒结构蛋白的辅助质粒混合vsvg蛋白、jaj-pol蛋白、rev蛋白,室温孵育20分钟后,转染dmem培养基中的hek293t细胞,37℃、5%co2培养,实现靶标基因片段的转录、病毒外壳蛋白的表达和病毒组装,组装好的病毒分泌胞外。

10.根据权利要求4所述的一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质的制备方法,其特征是,所述真空冷冻干燥的方法为:

初步冷冻:将产物在-50℃下保持5小时,然后在-50℃下在0.1mbar下再保持1小时;初步干燥:在1小时内将温度升至-20℃,并在-20℃下保持30小时;

二次干燥:在10个小时内将温度从-20℃升至25℃,在25℃、0.03mbar下保持15小时。


技术总结
本发明公开了一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质,所述标准物质以病毒为载体,包裹新型冠状病毒核酸检测的靶标基因。本发明还公开了一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质的制备方法,包括:合成靶标基因;将靶标基因分别载入病毒质粒载体;将病毒质粒转化入大肠杆菌进行培养;分离、回收病毒质粒;将病毒质粒转染HEK293T细胞并进行病毒包装;将包装好的病毒颗粒提纯、重悬后,加冻干保护剂分装,经真空冷冻干燥后封装。本发明具有病毒拟似结构和新型冠状病毒的特异性核酸序列,可以作为新型冠状病毒的标准品实现RNA的绝对定量,并且可以参与从病毒核酸提取到PCR结果读取的全部检测步骤,控制核酸检测结果的准确性。

技术研发人员:林婧;王尚君;夏雪;徐峰;朱文
受保护的技术使用者:南京市计量监督检测院
技术研发日:2020.06.23
技术公布日:2020.10.30
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