基于EZMTT试剂的抗生素药敏和化合物抗菌活性检测方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及一种基于ezmtt试剂的抗生素药敏和化合物抗菌活性检测方法。

(二)

背景技术：

抗生素的滥用，包括患者对处方的滥用以及在动物饲料和其他农业应用中使用，导致目前许多微生物对在过去效果良好的抗生素产生耐药性。金黄色葡萄球菌(s.aureus)是革兰氏阳性病原体，最常从社区和医院获得性感染中分离，mrsa指那些表达了meca或其他对甲氧西林耐药机制的金黄色葡萄球菌(mrsa)，甲氧西林于1961年被发现后很快就后全球广泛使用。现在甲氧西林由于其毒性而不在用于人类，而被更稳定的青霉素所替代，但“mrsa”一词仍作为术语使用，且如果头孢西丁或奥沙西林的药敏试验(antimicrobialsensitivitytest，ast)结果显示具有耐药性，则可确认为mrsa分离株。mrsa感染有轻度的皮肤感染至严重导致死亡的感染。万古霉素是mrsa的一线抗生素，大多数mrsa都对万古霉素有敏感性，但应对具有万古霉素中等抗性的金黄色葡萄球菌的负担相对较高，并且耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(vrsa)也越来越常见。建立简单方便准确敏感的抗生素药敏筛选试验方法尤其重要。ast方法可以为医生提供微生物的耐药状态，以便医生选择正确的抗生素。常用的ast方法包括肉汤稀释测试，抗微生物梯度法，纸片扩散法和自动化仪器系统。这些方法均报告了易感性(s)，中度敏感(i)或耐药(r)的分类结果，以用于临床指导。肉汤微稀释法和快速自动仪器法是使用最广泛的方法。vitek2卡系统通过监测细菌生长的浊度来报告类别，并由于其高度自动化，快速和可靠的特性而被广泛采用。mtt通常用于细胞毒性测定以获得ic50作为终点测定，来用于微生物的ast试验。ezmtt是一种基于nad(p)h的检测试剂，适用于细菌的增殖检测。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种基于ezmtt试剂的抗生素药敏和化合物抗菌活性检测方法。

本发明采用的技术方案是：

基于ezmtt试剂的抗生素药敏检测方法，所述方法包括：

(1)制备mh培养基(mueller-hinton，水解酪蛋白培养基)称取camhb(cationadjustedmueller-hintonbroth，阳离子调节肉汤)培养基粉末(21g)，加去离子水(1l)充分搅拌至完全溶解，高压灭菌，得到mh培养基；

(2)制备mh琼脂培养基平板：称取camhb培养基粉末(21g)和琼脂粉末(15g)，加去离子水(1l)充分搅拌至完全溶解，高压灭菌，所得mh琼脂培养基加热至完全熔化，冷却至45～60℃，倒于无菌培养皿中，凝固得到mh琼脂培养基平板、倒置备用；

(3)将金黄色葡萄球菌在mh琼脂培养基平板上划线，在35～37℃隔水式培养箱中培养24～48h；

(4)配制mcf0.5菌液：取步骤(3)mh琼脂培养基中单菌落，用生理盐水(0.9％nacl溶液)稀释调整，于96孔板中测定od600值，使其位于mcf0.5范围内；配制mcf0.5(麦氏浊度0.5，相当于1.5×10⁸cfu/ml)的标准溶液：9.95ml1％h2so4+50μl1.175％bacl2混匀，因产生ba2so4沉淀，每次使用前均需混匀，于96孔板中测定其od600值范围，所得的od600值作为前述稀释菌液需要达到的值。

(5)将步骤(4)mcf0.5菌液稀释，加入ezmtt试剂，取200μl加入含有梯度浓度的抗生素药液的96孔板中进行药敏实验1～24h，每隔0.5～1h测定一次od450值；设定空白组，即不加菌液，只加200μlmh培养基；另设对照组，即不加抗生素，只加200μlmh配制的菌液，以吸光值为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制吸光度-生长时间关系ezmtt药敏生长曲线；

步骤(5)中菌液稀释倍数根据菌株生长曲线进行选择，以金黄色葡萄球菌atcc29213为例，稀释2×，10×，100×，1000×不同倍数，ezmtt法生长曲线按mcf0.5稀释一定倍数并加入ezmtt检测试剂后取200μl与96孔板每隔0.5-1h读数od450：浊度法生长曲线按mcf0.5稀释一定倍数后取200μl于96孔板中每隔0.5～1h读数od600或od750，做出相应的生长曲线(参见图1)，可见当稀释倍数为1000×时，菌株进入快速增长指数期所需的迟滞期时间越长，平台期更明显，因此选该稀释倍数进行ezmtt法药敏生长曲线实验。由于ezmtt在使用浓度时没有毒性，并且比浊度法具有更大的信号窗口，因此ezmtt适合于追踪抗生素敏感性曲线。

所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌atcc29213。

所述金黄色葡萄球菌也可为金黄色葡萄球菌mrsa-xhx菌株和s菌株的混合物。根据两个菌株(菌株s属于mssa(甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌)；菌株mrsa-xhx属于or-mrsa(对oxa耐药的mrsa菌株))的抗生素敏感性生长曲线，在选择的使用浓度下，可以将其分为三种类型：所有生长类型；无增长类型；以及中浓度增长型。

混合一定比例的mrsa-xhx和s菌株，可以研究金黄色葡萄球菌亚群耐药时的抗生素行为。通过比较mrsa-xhx和s的抗生素敏感性增长曲线，选择了四种抗生素，分为两种类型：高耐药性cip，fox属于mrsa-xhx的所有生长类型；中间抗性gen，tet属于mrsa-xhx的中等浓度生长类型。这四种抗生素的所有曲线均显示左移和上移，耐药率(混合物的mrsa-xhs％)从低到高。当耐药率达到0.01％时，高耐药性cip和fox组的ast即变为耐药。对于中等耐药组，gen和tet甚至在耐药mrsa-xhs比例达到10％时其结果仍为敏感，这是正常的，因为这两种抗生素的耐药性较弱。

与vitek卡相比，ezmtt的ast评价结果显示出很高的精度，一致率超过99％(表3),只有mrsa-wxm的gen不一致(ezmtt＝8μg/ml,i；vitek＝4μg/ml,s)。进一步用此方法筛选测试化合物的抗菌活性，可以简单而精确地筛选化合物对金黄色葡萄球菌菌株的抗菌能力。此外，依布硒林(ebselen)被报道具有抗菌活性，特别是对于与硫氧还蛋白(trx)系统有关的革兰氏阳性细菌。ebselen还被报道与银离子具有对多药耐药革兰氏阴性细菌的协同抗菌作用。己烷硒林(hexylselen)作为ebselen的衍生物也可以抑制硫氧还蛋白还原酶(trxr)。因此，本发明基于ezmtt法检测了ebselen及其衍生物hexylselen对金黄色葡萄球菌的抗菌能力，结果与预期的一致。ebselen和hexylselen对mrsa具有一定的抗菌效果，可进一步通过抗菌药敏测试筛选得到良好抗菌活性的ebselen类衍生物。

本发明还涉及一种基于ezmtt试剂的化合物抗菌活性检测方法，所述方法包括：

(1)制备mh培养基：称取camhb培养基粉末(21g)，加去离子水(1l)充分搅拌至完全溶解，高压灭菌，得到mh培养基；

(2)制备mh琼脂培养基平板：称取camhb培养基粉末(21g)和琼脂粉末(15g)，加去离子水(1l)充分搅拌至完全溶解，高压灭菌，所得mh琼脂培养基加热至完全熔化，冷却至45～60℃，倒于无菌培养皿中，凝固得到mh琼脂培养基平板、倒置备用；

(3)将金黄色葡萄球菌在mh琼脂培养基平板上划线，在35～37℃隔水式培养箱中培养24～48h；

(4)配制mcf0.5菌液：取步骤(3)mh琼脂培养基中生长状态良好的单菌落，用生理盐水(0.9％nacl溶液)稀释调整，于96孔板中测定od600值，使其位于mcf0.5范围内；

(5)将步骤(4)mcf0.5菌液稀释，加入ezmtt试剂，取200μl加入含有梯度浓度的化合物溶液的96孔板中进行药敏实验1～24h，每隔0.5～1h测定一次od450值；设定空白组，即不加菌液，只加200μlmh培养基；另设对照组，即不加化合物，只加200μlmh配制的菌液，以吸光值为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制吸光度-生长时间关系ezmtt药敏生长曲线；

所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌atcc29213。

所述金黄色葡萄球菌也可为金黄色葡萄球菌mrsa-xhx菌株和s菌株的混合物。

本发明的有益效果主要体现在：本发明基于ezmtt试剂的药敏检测方法在评估体外化合物抗菌作用方面显示出巨大的潜力。

(四)附图说明

图1为金黄色葡萄球菌atcc29213不同稀释倍数的生长曲线。

图2为s菌株(mssa)和mrsa-xhx菌株(or-mrsa)的药敏生长曲线。

图3为不同比例(0，0.001-100％)的s和mrsa-xhx的高度耐药(fox，cip)的药敏生长曲线。

图4为不同比例(0，0.001-100％)的s和mrsa-xhx的中度耐药(gen,tet)的药敏生长曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.质量控制确保所用抗生素有效

为了确保购买的抗生素足够有效，选择clsi(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，临床实验室标准协会)推荐的金黄色葡萄球菌atcc29213作为质量控制菌株。在表1中，可以看到除卡那霉素，磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和美罗培南外，大多数抗生素的最小抑菌浓度值均在clsi给定的标准中。对于卡那霉素，最小抑菌浓度值为0.5μg/ml，但标准范围为1～4μg/ml，这不会影响我们判断金黄色葡萄球菌是否含抗药性的结果，因此仍然在随后的实验使用卡那霉素。但是对于磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和美罗培南，atcc29213在实验数据和标准数据之间显示出很大的差异，因此未使用有关磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和美罗培南的所有数据。

2.ezmtt微量肉汤稀释法验证mrsa.

通过头孢西丁的vitek2卡法确认了临床分离的mrsa.的21株。本发明使用这21个菌株和其他2个mssa菌株(atcc25923和临床分离的菌株s)，通过ezmtt微量肉汤稀释法对甲氧西林，苯唑西林和头孢西丁进行了药敏试验测定，具体方法如下：

将mcf0.5菌液，再进行1000×稀释，取200μl稀释成的菌液加入含有系列浓度梯度(2×)甲氧西林，苯唑西林和头孢西丁药液的96孔板中通过在对应的浊度法药敏测试实验的20～24h后再加入ezmtt(200×)试剂。设定空白组，即不加菌液，只加200μlmh培养基；对照孔，即不含抗生素，只加200μl菌液。使用全自动荧光酶标仪测定一次od450值，使用软件originpro以抑制率为纵坐标，抗生素浓度为横坐标绘制ezmtt药敏测试抑制曲线。

抑制率通过下式得到：抑制率＝100-100*(实验孔-空白组)/(对照组-空白组)

处理抑制率数据得到24h抑制曲线，通过抑制曲线得到相应的最小抑菌浓度mic值。

结果如表2所示，通过ezmtt法测得的最小抑菌浓度值显示出100％的头孢西丁抗性，与vitek2卡一致。至于甲氧西林，由于其高毒性已不再用于患者中，因此没有报告。结果中21种mrsa菌株的苯唑西林的不同结果，引起了我们的兴趣：11/21(近52％)对苯唑西林有抗性，而10/21(近48％)对苯唑西林敏感。在以下内容中使用了对苯唑西林敏感的mrsa(os-mrsa)和对苯唑西林耐药的mrsa(or-mrsa)。

3.ezmtt方法对os-mrsa和or-mrsa的ast与临床vitek2卡高度一致

将21株mrsa分为两类：对oxa敏感的mrsa菌株命名为os-mrsa，对oxa耐药的mrsa菌株命名为or-mrsa。表3和表s1分别列出了mssa、os-mrsa和or-mrsa的ezmtt法与vitek2药敏纸片法的敏感、中介与耐药结果，对比表3和表s1的ezmtt法和vitek2药敏纸片法的结果进行分析，很容易可以得出ezmtt法结果与vitek2药敏卡片法结果高度一致。

1)基于ezmtt方法的os-mrsa和or-mrsa药敏测试结果及mic值：

将mcf0.5菌液，再进行一定倍数稀释，取200μl稀释成的菌液加入含有相应系列浓度梯度(2×)抗生素药液的96孔板中。通过在对应的浊度法药敏测试实验的20-24h后，再加入ezmtt(200×)试剂，使用全自动荧光酶标仪测定一次od450值，使用软件originpro以抑制率为纵坐标，抗生素浓度为横坐标绘制ezmtt终点法药敏测试抑制曲线。

抑制率通过下式得到：抑制率＝100-100*(实验孔-空白组)/(对照组-空白组)

处理抑制率数据得到24h抑制曲线，通过抑制曲线得到相应的最小抑菌浓度mic值。

2)基于vitek2卡法的os-mrsa和or-mrsa药敏测试结果及mic值：

表3，表s1和表s2通过ezmtt方法和临床vitek卡显示了2个mssa和10个os-mrsa的ast分配和mic值。而表4、表s3和表s4则显示ast工作和11种or-mrsa的mic值。

通过这些表，发现ezmtt结果与临床vitek卡结果高度一致。也就是说，本发明从ezmtt实验获得的结果是可靠和准确的。因此，在下文中，当提到ast结果时，指的是除克林霉素之外的ezmtt方法的结果。因为当金黄色葡萄球菌对红霉素有抗药性时，除非进行了d检验，否则无法估计金黄色葡萄球菌是否对克林霉素敏感，因此，在提及克林霉素时，考虑了临床vitek结果。根据clsi的执行标准，将15μg/ml红霉素和2μg/ml克林霉素药物纸放在mcf0.5金黄色葡萄球菌铺好的mh板中，间隔15～26mm，在35℃下孵育16～18h后，可以判断结果：如果克林霉素的抑菌环看起来像字母d，则结果为阳性，且红霉素诱导的克林霉素耐药。如果克林霉素的抑菌环保持圆形，则结果为阴性且对克林霉素敏感。

根据clsi推荐的微量稀释法给出的最小抑菌浓度值折点，通过ezmtt方法报告了ast结果(s，i，r)。折点如下：苯唑西林(2-4μg/ml)；头孢西丁(4-8微克/毫升)；青霉素g(0.12-0.25μg/ml)；环丙沙星(1-4μg/ml)；左氧氟沙星(1-4μg/ml)；莫西沙星(0.5-2μg/ml)；庆大霉素(4-16微克/毫升)；卡那霉素(16-64微克/毫升)；四环素(4-16微克/毫升)；二甲胺四环素(4-16μg/ml)；利福平(1-4μg/ml)；红霉素(0.5-8μg/ml)；克林霉素(0.5-4μg/ml)；万古霉素(2-16微克/毫升)；氯霉素(8-32微克/毫升)；利奈唑啉(4-8μg/ml)。

对于os-mrsa(表3，表s1和表s2)，可以看到对抗生素的耐药性不是很严重：2/10显示出环丙沙星耐药性(2i)；4/10表示卡那霉素耐药(1i；3r)；1/10表示四环素耐药(1r)；5/10表示红霉素耐药(5r)；5/10显示克林霉素耐药(5r)；1/10表示氯霉素耐药(1r)。100％的青霉素g耐药符合预期。这些抗生素(左氧氟沙星，莫西沙星，庆大霉素，二甲胺四环素，利福平，万古霉素，利奈唑林)没有耐药性。

对于or-mrsa(表4，表s3和表s4)，耐药情况更为严峻和令人担忧：所有11种菌株均显示出对许多测试抗生素(青霉素g，环丙沙星，左氧氟沙星，莫西沙星，红霉素，克林霉素)的耐药性；只对3种抗生素(利福平，万古霉素，利奈唑林)均敏感。7/11表示庆大霉素耐药(4i；3r)；9/11表示卡那霉素耐药(1i；8r)；8/11表示四环素耐药(8r)；2/11表示二甲胺四环素耐药(2r)；3/11显示了氯霉素耐药(1i；2r)。

此外，表s1和表s3显示，与os-mrsa相比，对于五个头孢烯类或β-内酰胺类联合制剂(头孢他定，头孢唑林，头孢吡肟，头孢哌酮，哌拉西林/舒巴坦钠)而言，os-mrsa的ast结果敏感性更高。

分析上面提到的内容，可以发现，即使处理mrsa，也存在两种差异类型：os-mrsa和or-mrsa。根据ast结果，os-mrsa有更多的抗生素可供选择，or-mrsa的抗生素使用更受限。

4.基于ezmtt的抗生素-药敏曲线显示比浊度更宽的信号窗口

如前所述，我们讨论了通过ezmtt微量肉汤稀释法检测的最小抑菌浓度值。ezmtt试剂也可以追踪并显示抗生素敏感性增长曲线。图2显示了一些典型的抗生素曲线，在使用的浓度范围内有三种模式：全生长型；无增长型；浓度增长型。mrsa-xhx对头孢西丁，环丙沙星和红霉素表现出较高的耐药性，它们的抗生素敏感性曲线均属于全生长型。s和mrsa-xhx混合物的抗生素敏感性增长曲线解释了当一定比例的细菌变得耐药时，该曲线表现出耐药性

图3和图4显示了在一定比例的混合物中(s和mrsa-xhx)头孢西丁(fox)，环丙沙星(cip)，庆大霉素(gen)，四环素(tet)的抗生素敏感性增长曲线。在该模型中，可以看到，随着耐药菌比例的增加，所有这四种抗生素的药敏曲线均向左移和向上移。对于不同的抗生素，判断该混合系统是否具有抗药性或敏感性的比率是不同的。对于头孢西丁和环丙沙星，混合物的0.1％mrsa-xhx具有抗性。但是对于庆大霉素和四环素，即使混合物的10％mrsa-xhx也反映敏感。

5.依布硒林(ebselen)，已烷硒林(hexylselen)保持对mrsa的敏感性

表5表明ebselen，hexylselen对mrsa保持敏感性。无论mssa，os-mrsa还是or-mrsa，ebselen，hexylselen的最小抑菌浓度值值均在1～4μm之间，ebselen的最小抑菌浓度值集中在2～4μm，而hexylselen的最小抑菌浓度值集中在1～2μm。

表1：用于质控的抗生素药敏检测结果(金黄色葡萄球菌atcc29213)

表2：ezmtt法对金黄色葡萄球菌和临床分离出的mrsa进行药敏检测

表5：通过ezmtt法检测不同的金黄色葡萄球菌菌株对硝酸银，依布硒林，己烷硒林的药敏生长曲线

表6：抗生素缩略词简表