本发明涉及生物
技术领域：
：，尤其一种重组tev蛋白酶表达载体、表达系统及应用。
背景技术：
：：烟草蚀纹病毒蛋白酶(tobaccoetchvirusprotease,tevp)是一种来源于烟草蚀纹病毒(tev)nla的重组蛋白酶，因其显著的特异性，而被广泛应用于生化领域。标准的tevp含是一种含有242个氨基酸，分子量大小为27kda的c型半胱氨酸蛋白酶，它能够从重组蛋白的c端和n端有效去除移除融合蛋白的标签。同其它蛋白酶相比，tevp具有明显的优点。首先，tevp具有高度特异性，能够有效的识别七氨基酸序列exxyxq(g/s)，其中，enlyfqg是最普通特异性氨基酸序列识别序列，谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间为其切割位点；其次，它的重组蛋白能够很容易的在大肠菌中进行有效的过表达；再次，该酶反应条件温和，在4-30℃和ph5.5-8.5的广泛范围缓冲溶液内皆有较高的活性，使得可根据目的蛋白的情况选择适宜的反应条件。因此，tevp已成为融合标签去除的首选蛋白酶之一，尤其在重组蛋白n端融合标签的构建和切除中有着独特的优势。tevp在裂解融合蛋白标签时具有许多明显的优势，但是它同时也存在一些固有的缺陷。tevp在大肠菌中的表达量过低，并且其溶解度也很低；如文献《tobaccoetchvirusprotease:mechanismofautolysisandrationaldesignofstablemutantswithwild-typecatalyticproficiency》(kapustrb,tozserj,foxjd,andersonde,cherrys,copelandtd,waughds.protein.eng.2001.14:993～1000)中研究发现:野生型tevp的溶解度一般都低于1mg/ml，并且须保存在含有高达50％甘油的特殊缓冲液当中，这明显不利于tevp的工业化生产，同样也不利于tevp的有效储存。tevp在溶液中相对不稳定，很容易发生自我降解；如文献《crystalstructureoftobaccoetchvirusproteaseshowstheproteincterminusboundwithintheactivesite》(nunncm,jeevesm,cliffmj,eta1.j.mol.biol.2005,350:145～155)中研究发现:tevp会在其c端第218残基后面发生自我降解，并且降解生成的短肽的催化活性很低，极大地限制tevp的实际应用。因此，为了更加有效的利用tevp，迫切希望找到一种表达量高，溶解性强，能够抑制其自我降解和聚结，并且具有较高活性的重组tevp。目前也有不少关于tev蛋白酶突变体研究：如公开号为cn109055339a的专利提供了一种tev蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用，涉及基因工程
技术领域：
：。该tev蛋白酶突变体与具有如seqidno.1所示的氨基酸序列相比，突变至少如下七个氨基酸残基：第17位由t突变为s；第56位由l突变为v；第68位由n突变为d；第77位由i突变为v；第135位由s突变为g；第219位由s突变为v；第233位由q突变为h。该tev蛋白酶突变体具有良好的酶活性、稳定性和特异性。同时由于突变点位较多，虽然酶可溶性和表达量增加了，但酶的活性却有所下降。如公开号为cn101864407a的专利一种tev蛋白酶突变体，与原始tev蛋白酶相比，第17位由丝氨酸(ser)取代苏氨酸(thr)，第56位由缬氨酸(val)取代亮氨酸(leu)，第68位由天冬氨酸(asp)取代天冬酰胺(asn)，第77位由缬氨酸(val)取代异亮氨酸(ile)，第135位由甘氨酸(gly)取代丝氨酸(ser)。本发明还提供了突变体的编码基因及其含有编码基因的表达载体和宿主细胞以及突变体在大肠杆菌中进行蛋白重组表达的应用。采用定点突变技术改造tev蛋白酶基因，特异性的改变tev蛋白酶中的五个氨基酸残基，获得的tev蛋白酶的突变体可溶性和酶活性均得到显著的提高。但由于第219位的丝氨酸没有突变，蛋白容易发生自我降解，蛋白存在稳定性不高的问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种重组tev蛋白酶表达载体、表达系统，实现tev蛋白酶在大肠杆菌中的高效表达，以获得大量高纯度的tev蛋白酶，为tev蛋白酶的推广应用奠定基础；具体是通过以下技术方案实现的：一种重组tev蛋白酶表达载体，将his-tevp重组蛋白插入pet-21a载体得到重组tev蛋白酶表达载体。优选地，所述his-tevp重组蛋白的生产方法为：将四点突变型tevp基因插入到pet-21a质粒的多克隆位点制得重组质粒pet-21a-tevp；然后采用重组质粒pet-21a-tevp转化e.colibl21(de3)，利用amp抗性筛选阳性克隆，iptg或乳糖及其类似物诱导表达后产生his-tevp重组蛋白。his-tevp重组蛋白具有如seqidno.1所示的氨基酸序列。优选地，所述四点突变型tevp基因，与原始tevp蛋白酶相比，第17位的苏氨酸突变为丝氨酸，第56位的亮氨酸突变为缬氨酸，第135位的丝氨酸突变为甘氨酸，第219位的丝氨酸突变为缬氨酸，同时在n端添加了6xhis标签。一种重组tev蛋白酶表达系统，包括将所述重组tev蛋白酶表达载体导入大肠杆菌得到重组tev蛋白酶表达菌株。优选地，所述大肠杆菌为e.colibl21(de3)感受态。本发明还提供了一种上述重组tev蛋白酶表达系统在生产高纯度tev蛋白酶中的应用。优选地，所述应用，采用上述重组tev蛋白酶表达系统表达tev蛋白酶，再经提取和纯化而得到。需要说明的是，上述应用，是将重组tev蛋白酶表达系统置于lb液体培养基中,37℃培养，表达tev蛋白酶。优选地，所述纯化，将提取的tev蛋白酶先经ni2+-nta-sepharose亲和层析柱，再经脱盐柱g-25脱盐，再将蛋白样品进行分子筛层析，优选地，所述脱盐条件为:柱平衡缓冲液为50mm磷酸盐缓冲液，ph7.0,流速为1ml/min；ni2+-nta-sepharose亲和层析条件为:柱平衡缓冲液为50mm磷酸盐缓冲液，ph7.0；上样后，分别用含10，20，50，100mmol/l咪唑的缓冲液梯度洗涤杂蛋白；再用含200mmol/l咪唑的缓冲液洗脱得到his-tevp。表达菌株重组质粒提取结果表明：菌株中成功转入了重组质粒；如附图3所示；sds-page结果显示，获得大小为27kda的重组tevp蛋白(附图4所示)，这与野生型tevp蛋白大小相同。本发明还对重组tev蛋白酶表达系统表达tev蛋白酶的表达条件剂纯化条件进行了优化研究：表达条件的优化结果显示：在20℃，iptg浓度为0.5mmol/l，诱导时间为12小时的条件下，可溶性tev蛋白酶的表达量最高(附图5所示)。纯化条件优化结果显示：先经ni2+-nta-sepharose亲和层析柱(柱平衡缓冲液为50mm磷酸盐缓冲液，ph7.0；上样后，分别用含10，20，50，100mmol/l咪唑的缓冲液梯度洗涤杂蛋白。再用含200mmol/l咪唑的缓冲液洗脱得到his–tevp)，再脱盐柱g-25脱盐，最后将蛋白样品进行分子筛层析，即可得到纯度90％以上tev蛋白酶(附图6所示)。bradford法测定tevp的浓度结果如附图7所示，结果表明：t17s，l56v，s135g和s219v四点突变显著提高了tevp的溶解度。通过计算得出，tevp的浓度达到1.42mg/ml，每升菌液，可得到超过40mg的纯化的tev蛋白酶。本发明的有益效果在于：野生型的tevp在大肠菌中的表达量过低，其溶解度也很低，一般都低于1mg/ml，须保存在含有高达50％甘油的特殊缓冲液当中，且它在溶液中相对不稳定，很容易发生自我降解，降解生成的短肽的催化活性很低。本发明针对tevp表达量少、溶解性低、以及自我降解的问题，定点突变17位的苏氨酸为丝氨酸，56位的亮氨酸为缬氨酸，135位的丝氨酸为甘氨酸，以及219位的丝氨酸为缬氨酸，同时在n端添加了6xhis标签，构建ltevp重组表达载体pet21a-tevp(t17s，l56v，s135g和s219v)，并转化到大肠杆菌e.colibl21中进行表达，获得重组表达菌株。利用含有该重组表达菌株的tev蛋白酶表达系统生产tev蛋白酶，获得大量高纯度的tev蛋白酶；tev蛋白酶的纯度可达到90％以上；生产菌液中tevp的浓度可达1.42mg/ml，每升菌液可得到超过40mg的高纯度tev蛋白酶。本发明提供的重组tev蛋白酶表达载体、表达系统，为tev蛋白酶的推广应用奠定了基础。附图说明图1为质粒pet-21a的结构示意图。图2为his-tevp重组蛋白的序列示意图。图3为表达菌株重组质粒的提取结果。图4为sds-page检测tevp在e.colibl21中的表达结果。图5为不同诱导条件下tevp可溶性表达的sds-page分析，1:20℃,0.25mmol/l,12h；2:20℃,0.5mmol/l,6h；3:20℃,0.5mmol/l,12h；4:29℃,0.5mmol/l,6h；5:29℃,0.75mmol/l,8h；6:29℃,1.0mmol/l,12h。图6为sds-page分析纯化的tevp，1:20mm咪唑洗脱；2:50mm咪唑洗脱；3:100mm咪唑洗脱；4:200mm咪唑洗脱；5:50mm咪唑洗脱除去杂蛋白，在由200mm咪唑洗脱得到的纯化的tevp；6：脱盐过分子筛后得到tevp蛋白溶液。图7bradford法测bsa蛋白浓度标准曲线图。具体实施方式下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。实施例1一、实验材料、试剂与实验仪器1.1实验材料e.colibl21(de3)为本实验室保存菌株。重组质粒pet-21a-tevp为加拿大laval大学dr.michelvincent馈赠。质粒pet-21a的结构示意图如附图1所示。将四点突变型tevp(t17s，l56v，s135g和s219v)基因插入到pet-21a质粒的多克隆位点，重组质粒pet-21a-tevp转化e.colibl21(de3)后利用amp抗性筛选阳性克隆，iptg诱导表达后产生his-tevp重组蛋白。1.2主要试剂及来源ni2+-nta-sepharose为amersham公司产品。iptg试剂为sigma公司产品。酵母提取物和蛋白胨来自于oxiod公司。质粒提取试剂盒来自于天根公司。从商业来源获得的其他试剂全部达到分析纯试剂等级，并且使用双蒸去离子水配制。含25mmol/ltris–hcl，100mmol/lnacl的缓冲液a用于溶解tevp蛋白。所需ph值使用hcl或者naoh调整。1.3常用培养基lb固体培养基：1000mllb固体培养基含胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g、琼脂粉16g；ph7.0，121℃湿热灭菌20min。lb液体培养基：1000mllb液体培养基含胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g；ph7.0，121℃湿热灭菌20min。1.4常用溶液1.4.1质粒转化、蛋白表达用试剂：①氨卞青霉素(amp)储液：100mg/l；②100mmol/liptg溶液，dmso(二甲基亚砜)-20℃下贮存。1.4.2电泳用溶液：①分离胶缓冲液(ph8.8):tris90.8g，sds2g，na-edta5.96g，加蒸馏水至500ml。②浓缩胶缓冲液(ph6.8):tris12.2g，sds0.2g加蒸馏水至200ml。③30％聚丙烯酰胺:29gacrylamide和1gbisacrylamide溶于60ml水中，加热至37℃溶解后，补水至100ml.过滤除菌，棕色瓶保存。④浓缩胶，5％page，0.1％sds，ph6.8，50mmol/l的tris-c1。⑤分离胶，15％page，0.1％sds，以ph8.8，50mmol/l的tris-hc1。⑥电泳缓冲液：25mmol/ltris-hc1，250mmol/l甘氨酸，0.1％sds。⑦加样缓冲液：2.0％巯基乙醇4％sds，20％甘油，0.001％溴粉蓝。⑧脱色液：冰乙酸100ml，乙醇200ml，加水定容至1000ml。1.4.3纯化用试剂：①缓冲液体a：25mmol/ltris–hcl，100mmol/lnacl，ph8.0。②elutionbuffer：缓冲液体a含400mmol/l咪唑。③washingbuffer：缓冲液体a含40mmol/l咪唑。④2mol/lnacl。⑤0.5mol/ledta。⑥0.5mol/l的硫酸镍。⑦1mol/lnaoh。⑧70％乙醇。1.5仪器仪器主要有：1.高压灭菌锅：中国上海申安医疗期有限责任公司；2.sw-cj-ic超净工作台：中国苏州安泰有限责任公司；3.恒温摇床：中国哈尔滨东明医疗有限责任公司；4.超声波破碎仪：宁波新芝生物科技有限公司；5.冷冻离心机：德国beckman公司；6.电泳槽mini-protean@：美国bio-rad公司；7.ph计：成都方舟科技有限责任公司，phc-4c+；8.色谱柱：安玛西亚，superose610/30；9.色谱仪：aktafplcupc-900；10.脱盐柱g-25。二、实验方法2.1e.colibl21感受态细胞的制备和转化2.1.1e.colibl21感受态细胞的制备方法①接种10μle.colibl21甘油菌(或挑取平板上一单菌落)于5mllb培养基中，37℃振荡培养过夜；②取4ml培养后种子菌液，转接到500ml的lb培养基中，于37℃振荡培养至种子菌液od600值达到0.3～0.4；③置于冰上冷却10分钟，从这步开始要保证后续所有步骤要在冰冷的条件下进行；④将培养菌液转入50ml灭菌离心管中，离心10分钟(4000rpm，4℃)，无菌条件下去除上清；⑤用40ml冰预冷的灭过菌的mgcl2溶液(0.1mol/l)悬浮细菌，加样枪轻柔冲洗，使菌体分散，离心10分钟(4000rpm，4℃)，无菌条件下去除上清；⑥用40ml冰预冷的灭过菌的cacl2溶液(0.1mol/l)重新悬浮细菌，加样枪轻柔冲洗，使菌体分散，冰浴30分钟，离心10分钟(4000rpm，4℃)，无菌条件下去除上清；⑦用4ml在冰预冷的灭过菌的cacl2溶液(0.1mol/l)于0.6ml100％已灭菌的甘油再次悬浮细菌，轻轻混匀；⑧将混匀的细菌分装成200μl每管，记录好日期及菌种类型，保存于液氮或者-80℃的冰箱中，备用；⑨感受态及感受态效率的检验：酶制备一批感受态细胞，均需要检测后方能用于下一步实验。用感受态细胞直接涂抹在加了amp的lb培养平板基作为负对照；用感受态细胞直接涂抹在未加amp的lb培养基平板作为正对照一；用已证明能够成功转化的质粒(具有amp抗性)转化感受态细胞后涂抹在加amp的lb培养基平板作为正对照二，检验这批感受细胞的感受性和感受效率。2.1.2重组质粒的转化按下述方法进行重组质粒的转化：①先从液氮或者是-80℃的冰箱中取出冻存的感受态细胞(200μl每管)，放置在冰上解冻；②吸取约100μl感受态细胞到一新的已灭菌的ep管中(此外，预留5μl的感受态细胞，涂抹到加了amp的lb培养基平板上作为负对照)，两管中分别加入2μl待转化重组质粒dna和已知的可以成功转化的质粒dna，后者用作正对照，用来检验转化的方法是否正确，冰上放置30分钟；③42℃恒温水浴锅中热击60(或90秒)秒后，立即于冰浴上放置5分钟；④迅速放置于冰上，5分钟后进行下一步步骤；⑤将已摄入外源质粒dna的感受态细胞转入培养试管中，该试管中有已预热至37℃的lb培养基，使总体积为1ml,温和振荡培养(200rpm左右1小时)；⑥将复苏的培养物转移至一灭菌ep管中，4℃离心(4000rpm，10分钟)，将大部分培养基倒掉，用剩余的培养基悬浮细胞，用加样枪将菌液加到lb平板上，菌液推棒涂布均匀，与此同时也要将先前预留的感受态细胞涂布到含有amp的lb平板上，作为负对照，先正置培养30分钟，后倒置培养过夜。2.2质粒dna的提取按照下述方法进行质粒dna的小量抽提：1.柱平衡步骤：向吸附柱cp4中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl,12000rpm(～13400g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)；2.取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm(～13400g)离心1分钟，尽量吸除上清。注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液p1(请先检查是否已加入rnasea)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。4.向离心管中加入500μl溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组dna。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。5.向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm(～13400g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。6.将上一步收集的上清液分次加入过滤柱cs(过滤柱放入收集管中),12000rpm(～13400g)离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱cp4中(吸附柱放入收集管中),(如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀.尽量地吸取上清)。7.12000rpm(～13400g)离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放入收集管中。8.向吸附柱cp4中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm(～13400g)离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放入收集管中。9.向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放入收集管中。注意：加入漂洗液pw后，如果室温静置2-5min，有助于更好地去除杂质。10.向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw,12000rpm(～13400g)离心lmin，倒掉收集管中的废液。11.将吸附柱cp4重新放回收集管中置于12000rpm(～13400g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、pcr等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱cp4开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。12.将吸附柱自科置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液tb，室温放置2min，12000rpm(～13400g)离心lmin，将质粒溶液收集到离心管中。注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中.重复步骤12。洗脱液的ph值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其ph值在7.0-8.5范围内(可以用naoh将水的ph值调到此范围),ph值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率。且dna产物应保存在-20℃，以防dna降解。质粒dna纯度检测:得到的质粒dna可用琼脂糖凝胶电泳检测纯度。2.3重组tevp的表达及表达条件的优化、纯化(1)将已转化好了重组质粒的宿主细胞均匀涂布在含amp的lb固体培养基上，挑取单克隆子至5ml含有相应抗性含(1×10－4g/ml氨苄青霉素)的lb培养基中，37℃，200rpm，培养至od600＝0.6左右。(2)向lb培养基中加入iptg至终浓度0.5mm，转移至28℃培养箱中，200rpm继续诱导培养，可以在4h，8h，12h分别取样以分析表达状况。(3)从试管中取出的1ml菌液12000rpm离心10min，收集菌体，经缓冲液a洗2次后，重悬细菌于1ml预冷的缓冲液a。(4)超声破碎细胞，参数选择：功率30％，超声3s，间歇2s，共10min，直至菌液清亮。将破碎液体4℃，12000rpm离心10min，分离上清和沉淀。(5)sds-page分析上清和沉淀的蛋白分布(具体操作参考sds-page方法)，若在上清中有明显的目的蛋白的条带，即可以放大培养进而纯化目标蛋白。以此为依据，挑选出表达效果最佳的菌株，保存菌种。(6)tevp表达条件的优化：对诱导温度、iptg浓度和诱导时间3个因子的进行优化试验，诱导温度分别为20，和29℃，iptg浓度分别为0.25，0.5，0.75和1.0mm，诱导时间分别是4小时，6小时、8小时和12小时；每组3个重复，sds-page分析重组tevp的可溶性表达情况。(7)确定最佳表达优化条件后，将菌株在此优化条件下放大培养后，12000rpm离心10min，收集菌体，经缓冲液a洗2次后，重悬细菌于20ml预冷的缓冲液a，重复步骤(4)。(8)裂解液经12000rpm离心，收集的上清，使上清以约1ml每分钟速度流经ni2+-nta-sepharose，使目的蛋白与柱子充分结合。(9)分别用含10，20，50，100mmol/l咪唑的缓冲液a梯度洗涤杂蛋白；再用含200mmol/l咪唑的缓冲液a洗脱得到tevp-his。(10)经ni2+-nta-sepharose纯化后的到得目的蛋白在以1ml每分钟速度通过aktafplc系统，用不含咪唑的缓冲溶液a洗脱蛋白，得到不含咪唑的tevp-his溶液。再经分子筛层析柱，得到纯化的tevp-his溶液。(11)向得到的纯化tevp-his溶液中加入10％甘油，-80摄氏度储存备用。(12)纯化各步骤所得样品进行sds-page聚丙烯酞胺凝胶电泳分析，sds-page方法如下：①按说明安装好电泳仪的玻璃板(bio-radminiii)，先制备15％分离胶，轻缓加入适量蒸馏水封口，室温静置15min以上，使得分离胶充分凝固；②倒出蒸馏水，并用洁净的滤纸将残留的水滴吸干净，制备5％浓缩胶，插好梳子，室温静置15min以上，使得浓缩胶胶充分凝固；③拔出梳子，加入1x电泳缓冲液，并用加样枪吸打凝胶孔道，防止混有杂质；④将样品(含1x样品处理液)加入点样孔，恒流(1ma/泳道)进行电泳，直至染料前沿接近凝胶底部；⑤电泳完毕，取下凝胶块，将之浸泡于染色液中，染色1h以上，必要时可以染过夜；⑥染色后，用蒸馏水冲洗凝胶块，用脱色液脱色时间为半小时以上，直至凝胶底色脱尽。在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。序列表序列表sequencelisting<110>贵州理工学院<120>一种重组tev蛋白酶表达载体、表达系统及应用<130><160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220>229<400>1ghhhhhhhgeslfkgprdynpisssichltnesdghttslygigfgpfii50tnkhlfrrnngtlvvqslhgvfkvkntttlqqhlidgrdmiiirmpkdfp100ppfpqklkfrepqreericlvttnfqtksmssmvsdtsctfpsgdgifwkh150wiqtkdgqcgsplvstrdgfivgihsasnftntnnyftsvpknfmelltn200geaqqwvsgwrlnadsvlwgghkvfmvkp229当前第1页12当前第1页12