鸭源鹅细小病毒人工致弱毒株及其应用的制作方法

本发明属于生物领域。具体地，涉及鸭源鹅细小病毒人工致弱毒株及其应用。

背景技术：

近年来，在我国福建省^[1]、山东省^[2]、安徽省^[3]和福建^[4]等省份的半番鸭和樱桃谷鸭中暴发流行新型鹅细小病毒病，鸭群感染后临床表现为发育迟缓、喙萎缩、舌头向外伸等，俗称大(长)舌病、或短喙-侏儒综合征等。该病多侵害10～30日龄的肉鸭，发病率15-100％，死亡率3-10％。患鸭出栏体重较健康鸭降低20-30％^5]，严重者仅为正常体重的50％^[6]。目前，该病的发病区域不断扩大，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。

传统的鹅细小病毒病又称小鹅瘟，以雏鹅小肠纤维素性、栓塞性病变为主要特征，具有传播快、死亡率高等特性。gpv主要感染30日龄以内的雏鹅和雏番鸭，临床表现为坏死性肠炎，死亡率高达80％-100％^[7]。虽然小鹅瘟病原与短喙-侏儒综合症的病原在分类学上都属于鹅细小病毒，两者的同源性高达98.7％。但是，由于其感染的宿主不同，发病症状不同。至今没有人报道两个病毒的致病机理。

1995年，z.zádori等首次发表了gpv的全基因组序列。gpv基因组约5100个核苷酸组成，基因组两端为回文序列折叠形成的发夹结构，基因组中均含有两个开放阅读框架(orf)^[8]。左侧orf编码两个非结构蛋白ns1和ns2；右侧orf编码三个结构蛋白vp1，vp2和vp3，其中vp3为衣壳蛋白，是主要的免疫保护性抗原，能诱导产生中和作用抗体。由于鹅细小病毒属于dna病毒，因此，它的变异极为缓慢。

技术实现要素：
：

本发明的目的是提供一种鹅细小病毒毒株gpv-zym，该毒株优选用作疫苗保护鸭避免感染鸭短喙综合征和/或雏鹅(番鸭)小鹅瘟。该毒株于2018年5月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京)，保藏编号为cgmccno.15700。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

2.鹅细小病毒毒株gpv-zym，该毒株的保藏编号为cgmccno.15700。

其核苷酸序列如seqidno：1所示。

3.疫苗，其包含项目1所述的鹅细小病毒毒株gpv-zym，在制备预防鸭或鹅感染鸭短喙综合征和/或小鹅瘟的疫苗中的应用。

4.制备鸭短喙综合征和/或小鹅瘟疫苗的方法，包括将项目1所述的鹅细小病毒弱毒株gpv-zym接种鹅胚成纤维细胞gef，37℃培养至细胞病变80％以上时，收集病毒培养液，病毒含量在tcid50大于等于10⁴/0.1ml时用于配制疫苗。

本发明将临床分离到的引起鸭短喙侏儒综合症(beakatrophyanddwarfismsyndrome，bads)的新型鸭源鹅细小病毒毒株经过鹅胚成纤维细胞连续传代培养3代后，再接种spf金锭鸭胚，如此反复交替传代120代，获得毒性减弱的鹅细小病毒致弱毒株gpv-zym。该弱毒株与genbank其他gpv毒株同源性在93.5-97.2％之间。该致弱毒株gpv-zym与我国商品化弱毒疫苗gd株(dq665790)和疫苗syg61-41毒株(dq299942)在核苷酸上的同源性分别为92.8％和93.0％，氨基酸同源性分别为95.3％和95.9％。表明弱毒株gpv-zym来自人工致弱毒株而非疫苗株。该毒株5‘非编码区带有gpv-zym弱毒株特有的分子标记gaacgaac和gttcgttc。其他genbank毒株以及商品化疫苗株没有该分子标记。该毒株培养物经1∶100倍稀释后，对樱桃谷肉鸭短喙综合症提供100％保护；并且对雏鹅或雏番鸭小鹅瘟也可提供100％的保护。1日龄雏鹅或雏番鸭只需免疫一次，第5天就能全程100％有效预防雏鹅或雏番鸭小鹅瘟病毒感染和鸭短喙综合症的发生。由其制备的活疫苗具有高效、安全、成本低的优点。

本发明的目的是保护鸭短喙综合症以及雏鹅和雏番鸭小鹅瘟的新型鸭源鹅细小病毒细胞致弱活疫苗的制备方法，本发明通过如下技术方案实现：

本发明利用gef和spf鸭胚交替连续传代致弱的gpv-zym毒株为种毒，应用gef制备的的活疫苗具有高效、安全、成本低的优点。

附图说明：

图1：免疫组化检测鹅细小病毒gpv-zym和强毒yg感染雏鸭小肠(a)和肝脏(b)抗原分布。

具体实施方式：

下面通过参考实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员应当理解，下述实施例仅是用于举例说明本发明的目的，其不应被以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。

实施例1.人工致弱的新型鹅细小病毒弱毒株gpv-zym株的获得

2015年在山东某樱桃谷鸭场爆发了疑似鸭短喙侏儒综合症，送检的鸭子均具有明显的短喙、长舌、瘦小等症状。死鸭体内充血严重，肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、小肠、胰脏都出血严重，甚至变性坏死。将病料进行研磨上清接种鸭胚，经鉴定为新型鹅细小病毒gpv。

前期研究表明gpv在鹅胚成纤维细胞(gef)和鸭胚成纤维细胞(def)中连续交替传代与其毒力的减弱有着重要的关系^[9-11]。随着病毒在细胞中的连续传代培养，宿主细胞与病毒的不断相互作用，使得病毒的毒力相关基因受到修饰而发生改变，使其毒力减弱甚至失去对宿主动物的致病能力。

我们将新分离到的引起鸭短喙-侏儒综合征的新型鹅细小病毒gpv在gef和spf金锭鸭胚进行连续交叉传代培养，期望获得可以预防鸭短喙-侏儒综合征的弱毒株。

具体过程如下：将zym亲本毒株传代3代后，接种spf金锭鸭胚(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，待鸭胚死亡后立即收获尿囊液，按照1∶100倍稀释后，接种由鹅胚制备的gef(购自哈市道里区新立养殖场)，培养6天收获病毒培养物，反复冻融三次后-70℃保藏。gef培养物按照1∶100倍稀释后，spf金锭鸭胚继续培养一代，然后在gef中连续培养3代，在相同的培养条件下，将最后一次培养物，按照1∶100倍稀释接种spf金锭鸭胚，收获病毒培养物，如此反复交替连续传代120代次。传代第120代次的毒株命名为gpv-zym。根据reed-muench方法，计算细胞毒tcid50。

第120代次毒株(命名为gpv-zym)生物学特征如下：

(1)毒株效价：在鹅胚成纤维细胞中效价更高，可达tcid50＞10^8.0/0.1ml；

(2)生物学信息分析：p120代gpv-zym与亲本病毒(亲本毒株经测序全基因如seqidno：9所示，ns蛋白和vp1蛋白的序列如seqidno：10和11所示)结构蛋白(vp1)之间的同源性仅为97.4％。致弱毒株gpv-zymvp3与我国商品化弱毒疫苗gd株(dq665790)和syg61-41毒株(dq299942)在核苷酸上的同源性分别为92.8％和93.0％，氨基酸上同源性分别为95.3％和95.9％。gpv-zym在非编码区分别带有该弱毒株特有的分子标记gaacgaac和gttcgttc。

(3)安全性：1-2日龄无gpv母原抗体健康雏鹅和雏番鸭各10只，每只肌肉注射种毒1∶1000倍稀释的gpv-zym和鹅细小病毒强毒yg^[12]原液0.2ml，观察30天，雏鹅和雏番鸭接种gpv-zym全部存活，接种gpv强毒yg株雏鹅和雏番鸭80％死亡。

(4)免疫保护：

对小鹅瘟的保护：免疫组：选取无gpv母源抗体1日龄雏鹅或番鸭各10只，肌肉注射最小免疫剂量为100tcid50/0.2ml，第7天后，雏鹅或番鸭接种鹅细小病毒强毒yg；对照组：1日龄雏鹅或番鸭各10只，肌肉注射pbs0.2ml，7天后，对照组雏鹅或番鸭接种鹅细小病毒强毒yg^[12]，结果，免疫gpv-zym的雏鹅或番鸭，用鹅细小病毒强毒yg攻毒后，100％保护，无发病和死亡。

对短喙侏儒综合症的保护：选取无gpv母源抗体1日龄樱桃谷鸭20只，10只肌肉注射最小免疫剂量为100tcid50/0.2ml，10只肌肉注射pbs0.2ml，第7天后，接种短喙侏儒综合症鹅细小病毒强毒fj-zz^[4]原液0.2ml，观察30天，结果免疫gpv-zym后攻毒fj-zz组100％保护，免没有发生短喙侏儒综合症，与正常对照组相比，体重增加正常；而没有免疫的对照组在攻毒后5只鸭发生了短喙，8只鸭生长缓慢，与正常相比体重均下降15％。

(5)选用鹅胚成纤维细胞培养，细胞病变达75％以上时收获病毒。

(6)弱毒种稳定性试验：弱毒株gpv-zym原液注射1日龄易感雏鹅，1ml/只，传5代，雏鹅传代后病毒可在肠道分离到病毒，但对肠道无病理学损伤，对雏鹅的生长发育无影响，与对照(未进行感染)无差异(图略)。参见图1a和b，图1a和1b的左侧为强毒yg感染，右侧为gpv-zym弱毒)，因此gpv-zym弱毒株无毒力返强现象，弱毒种稳定性良好。

将上述人工致弱的新型鹅细小病毒弱毒株gpv-zym株进行生物学信息分析：提取gpv-zym和亲本病毒的dna为模板，利用发夹结构特点，单引物p1：5-acgcgcatgccgcgcggtcag-3(seqidno：12)进行pcr扩增。

pcr产物回收后链接至t载体，经过基因公司测序后，获得的gpv-zym病毒的核苷酸序列。seqidno：1所示为全长核苷酸序列长度为4740bp；seqidno：2所示为5’非编码区序列；seqidno：3所示为ns基因核苷酸序列；seqidno：4所示为ns蛋白的氨基酸序列；seqidno：5所示为连接ns基因和vp1基因的序列；seqidno：6所示为vp1蛋白的核苷酸序列；seqidno：7所示为vp1蛋白的氨基酸序列；seqidno：8所示为3’非编码序列；seqidno：9所示为亲本病毒的全长核苷酸序列；seqidno：10所示为其ns蛋白的氨基酸序列；seqidno：11所示为vp1蛋白的氨基酸序列。

经过120代次的传代适应后，gpv-zym毒株在鸭体内复制能力显著下降，无临床发病症状。在gef中的复制能力稳定，病毒滴度明显增高(tcid50＝10⁸/ml)；致病性研究结果表明，1日龄雏鸭感染gpv-zym后，精神和采食量均正常，没有发生死亡和体重下降等现象。解剖后发现gpv-zym感染的雏鸭各个器官外观正常，病理组织学检查无病理变化；免疫组化检测显示，gpv-zym感染的雏鸭肝脏和肠道病毒含量明显比亲本强毒(或强毒yg或fj-zz)感染的少，说明其在雏鸭体内复制能力明显降低，病毒已经完全致弱。

免疫组化实验如下：

gpv-zym弱毒株和亲本毒zym分别在感染雏鹅后的第三天进行剖检，采集肝和小肠，采集之后立即用100ml/l中性福尔马林溶液进行固定，固定的组织样品经脱水、包埋后制成组织切片，对组织切片进行免疫组织化学法gpv抗原检测，单抗浓度为1∶300倍稀释后，pbs洗涤三次，然后用hrp-标记的抗鼠的二抗进行检测，以观察gpv在肝脏和肠器官中的分布情况。

与genbank其他毒株进化分析：通过dnastar软件进行序列分析显示，gpv-zym毒株与其他genbankgpv在同一个分支内，与gpv毒株的核苷酸同源性在93.5-97.2％。

gpv-zym毒株的vp3基因与我国商品化弱毒疫苗gd株(dq665790)和syg61-41毒株(dq299942)在核苷酸上的同源性分别为92.8％和93.0％，氨基酸上同源性分别为95.3％和95.9％。

将上述人工致弱的鹅细小病毒弱毒株gpv-zym毒株应用于小鹅瘟和短喙侏儒综合症新型疫苗的制备方法：gpv-zym按照1∶1000接种gef，37℃培养至细胞病变80％以上时，收集病毒培养液。病毒含量在tcid50大于等于10⁴/0.1ml时，可用于配制疫苗。

措施如下：

1.细胞培养液：含3％胎牛血清的dmem。

2.鹅胚成纤维细胞的制备：取15日龄鹅胚，蛋壳用碘酒或者酒精消毒，敲破气室，沿气室边缘去除蛋壳。用小镊子穿透绒毛膜，夹住胚的颈部取出胚，放入平皿中。用眼科剪去除头、四肢和内脏，之后剪碎胚体直至成乳糜状。用dmem反复冲洗3次，放入已灭菌的小青瓶中，加入3-4倍体积的edta-胰酶，放入37℃水浴锅中消化30min，10min摇晃一次。消化完成后弃上清，用dmem冲洗3次以去除胰酶。然后加入含10％血清的dmem，用枪反复吹100次左右，将消化后的组织块吹散，使细胞分散。用8层纱布过滤液体，去除未吹散的组织块等杂质。用红细胞计数板进行细胞计数，稀释细胞至10⁶个/ml。将细胞分装到细胞培养瓶中，在37℃，5％co2条件下培养。

3.病毒增值：病毒1∶1000稀释后接种原代成纤维细胞，37℃旋转培养，转速为10转/小时。观察细胞病变，当75％以上细胞出现病变时，将瓶体放置-20度冻存。

4.病毒含量测定：将病毒培养液按照1∶10¹；1∶10²；……1∶10⁶；1∶10⁷稀释，加入预先制备好的单层鹅胚成纤维细胞96孔板中，每个稀释度5孔，培养7天，计算tcid50。效价应大于等于10^5.5/ml。

5.安全检验：选1日龄健康易感雏番鸭或雏鹅各10只，每只肌肉注射10倍量的疫苗，观察30天，接种鹅未见发病，食欲、精神正常。且生长发育良好，全部存活。

6.效力检验：1)对小鹅瘟强毒的效力实验：10只一日龄易感雏鹅或雏番鸭肌肉注射1羽份疫苗，接种后第5天、10天、20天、30天，连同对照组10只，同时攻击yg。结果显示，免疫接种鹅和番鸭可抵抗强度的攻击，保护率达100％。而对照组鹅100％死亡，番鸭80％死亡。2)对短喙侏综合症病毒的效力实验：10只一日龄易感樱桃谷鸭肌肉注射1羽份疫苗，接种后第5天、10天、20天、30天，连同对照组10只，同时攻击短喙侏综合症病毒fj-zz。结果显示，免疫接种樱桃谷鸭可抵抗fj-zz的攻击，保护率达100％。而对照组樱桃谷鸭5只发生短喙，8只鸭体重下降15％。

7.弱毒种稳定性试验：弱毒株注射1日龄易感雏鹅，1ml/只，传5代，雏鹅传代后病毒可在肠道分离到病毒，但对肠道无病理学损伤，对雏鹅的生长发育无影响，与对照无差异(结果类似图1)，因此gpv-zym弱毒株无毒力返强现象，弱毒种稳定性良好。

序列表：

seqidno：1：gpv-zym毒株的核苷酸序列

seqidno：2gpv-zym毒株核苷酸的5’非编码区序列

seqidno：3gpv-zym毒株的ns基因序列

seqidno：4gpv-zym毒株的ns蛋白序列

seqidno：5链接ns基因与vp基因间的序列

seqidno：6gpv-zym毒株的vp1编码基因核苷酸序列

seqidno：7gpv-zym毒株的vp1蛋白氨基酸序列

seqidno：8gpv-zym毒株核苷酸的3’端非编码序列

seqidno9：zym强毒株基因序列(1-4692)

seqidno：10zym强毒株的ns蛋白氨基酸序列

seqidno：11zym强毒株的vp1蛋白氨基酸序列

seqidno：12p1∶5-acgcgcatgccgcgcggtcag-3

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