酪蛋白纯化方法和蛋白琥珀酸铁的制备方法与流程

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种酪蛋白纯化方法和蛋白琥珀酸铁的制备方法。

背景技术：

缺铁是一种广泛流行的世界性营养缺乏症，严重威胁着人类健康，正常人维持体内铁代谢平衡，每天需从外界摄取1~1.5mg的铁，孕妇和哺乳期妇女每天摄取铁的量需达到2~4mg，因此妊娠期妇女和哺乳期妇女更容易引发铁摄入不足。

最具代表性的缺铁性疾病就是缺铁性贫血，据世界卫生组织（who）统计，全世界三分之一的人存在缺铁性贫血，不论发达国家还是发展中国家缺铁性贫血患者的比例都很高。具统计，缺铁性贫血男性发病率为10%，女性为20%，孕妇可达到40%，儿童发病率超过50%。

补铁治疗起始于17世纪的英国，第一代以硫酸钠亚铁为代表的补铁制剂。包括碳酸亚铁、磷酸铁钠、氯化亚铁、焦磷酸铁、氨基磷酸铁等无机铁盐类制剂被开发为补铁剂。但这些无机盐类的补铁制剂使用铁离子直接补铁，存在严重的不良反应，且不易于吸收。

第二代补铁剂是小分子有机酸铁盐，代表药品包括乳酸亚铁、琥珀酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁（延胡索亚铁）等。第二代补铁剂解决了铁吸收率低的问题，使铁的吸收得到了普遍提高，但仍存在缺点，如乳酸亚铁浓重的铁秀味，并可引起恶心、呕吐，上腹疼痛等严重的胃肠不良反应；葡萄酸亚铁味涩、有焦糖臭，副作用类似于乳酸亚铁，其它二代补铁剂也存在类似的不良反应。

20世纪末以乙二胺四乙酸铁钠为代表的第三代补铁剂上市，这类补铁剂不再以离子的形式存在，而是把铁与小分子有机物络合形成螯合物。此类补铁剂去除了传统补铁剂的铁锈味，对胃肠道的刺激也不那么明显，性质也相对稳定。代表药品还包括甘氨酸铁、苏氨酸铁等。第三代补铁剂成本偏高，现在不能普及，其铁的吸收率虽有所提高，但还不尽人意。

近年来，以多糖铁络合、蛋白铁络合为主的大分子补铁制剂开始发展，而多糖铁络合物多以注射液的形式给药，生产成本高、患者使用不便。蛋白琥珀酸铁则具有良好的抗贫血作用，对铁摄入不足、急性或慢性失血、各年龄段感染所引起的显性或隐性失血等造成的绝对和相对贫血均有很好的治疗效果。

蛋白琥珀酸铁(iron-proteinsuccinylate，简称isp)是一种多肽类蛋白补铁药物，是意大利发马克大药厂80年代研制的产品，1987年在意大利上市并在全球20多个国家包括西班牙、葡萄牙、希腊、阿根廷、韩国等陆续上市发售。

蛋白琥珀酸铁为红棕色粉末，无特别气味，是酰化得酪蛋白与铁离子络合后的产物，其中铁离子通过分子间的作用力，与酪蛋白的酰化位点结合，被包裹在酪蛋白分子结构内，其在碱性条件下可溶解，在酸性条件下析出。

蛋白琥珀酸铁不被胃蛋白酶消化，却在中性ph值时可被胰蛋白酶水解。由于蛋白琥珀酸铁的这些性质，本品所含的铁受蛋白膜的保护而不同胃液中盐酸和胃蛋白酶发生反应，服用后无铁离子的胃肠道刺激反应，因此不会造成胃粘膜损伤。蛋白琥珀酸铁保持了酪蛋白对ph值的敏感特性，使其具有了肠靶向性。蛋白琥珀酸铁中的铁在十二指肠内开始释放，特别应在空肠中释放，因为正常ph值的升高使得这种化合物重新变得可溶，并且使蛋白膜为胰蛋白酶所消化。这样的铁非常有利于机体的生理吸收，却又不会形成太高的吸收峰；事实上，它呈现一种恒定的吸收趋势，在机体的各个部位逐渐达到吸收与贮存的最佳平稳状态。因此，蛋白琥珀酸铁一般不会产生胃肠的耐受性问题。总之蛋白琥珀酸铁吸收率不受胃酸减少、食物成分的影响，对胃肠道黏膜无刺激和腐蚀作用，避免了消化道的不良反应。尤其适用于妊娠与哺乳期妇女贫血的治疗。也适合有消化道溃疡，又伴缺铁性贫血的患者服用。

构成蛋白琥珀酸铁的蛋白主要为酪蛋白。酪蛋白结构组成比较复杂，包括αs1-、αs2-、β-和κ/假κ-酪蛋白四种类型。然而，由于酪蛋白来源与纯化工艺的复杂性，除了上述四种类型的酪蛋白外，食用级酪蛋白还含有不超过20%的杂蛋白或多肽。这些杂质的存在，使得酪蛋白带有苦味、涩味、辛辣味、氨味等不良风味，制备成溶液剂直接给药后患者顺应性差，特别是严重影响了幼儿患者长期服用的意愿。

专利cn107090011a指出如果将食用酪蛋白(所述食用酪蛋白已经经受旨在除去蛋白质杂质、无机杂质和/或提高磷/氮比例(p/n比例)的纯化工艺)用作原料，那么在琥珀酰酪蛋白铁的生产中可以获得令人吃惊的优势。但是该专利只考虑了所述蛋白质杂质的量为大约15％以下，优选大约10％以下，通过物理纯化的方式降低蛋白质杂质，但却不能完全消除杂质或降低杂质含量至极低水平。

国内目前已有蛋白琥珀酸铁口服溶液上市，但是相关专利多集中在制剂开发上，对蛋白琥珀酸铁的制备方法和表征的研究较少，对其微观结构的认知更是微乎其微。因此开发合适的蛋白琥珀酸铁的制备方法并进行质量控制具有现实意义。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种酪蛋白的纯化方法，另一个目的是将纯化后的酪蛋白用于蛋白琥珀酸铁的制备，及蛋白琥珀酸铁的表征，特别是微观结构的表征。所述纯化方法主要采用酶解法纯化酪蛋白，条件温和、安全性高、成本低和水解易于控制，该方法纯化出来的酪蛋白利用率提高且苦味降低，既缓解了胃肠道不适和也能够快速释放铁。另外，所述蛋白琥珀酸铁的制备方法采用了纯化的酪蛋白酰化得到琥珀酰蛋白，通过控制合适的酰化程度得到合适的琥珀酰蛋白和三价铁结合的络合常数k，从而达到释放铁的有效剂量和控制成本。上述方法具有制备方法简单和生产成本低的优势，能够很好的应用于蛋白补铁类药物的制备。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种酪蛋白的纯化方法，该方法包括以下的步骤：

1）采用酸性或者中性蛋白酶适度水解酪蛋白；

2）采用氨肽酶和羧肽酶结合的方式水解杂质蛋白和多肽；

3）根据等电点沉淀法除去水解后产生的氨基酸和寡肽，控制具有苦味氨基酸和寡肽的分子量。

优选，步骤1）水解用的蛋白酶为α-凝乳蛋白酶。

优选，步骤1）水解后的酪蛋白组成中αs1-酪蛋白含量小于40%，优选小于30%；β-酪蛋白含量小于40%，优选小于30%。

优选，步骤3）中的具有苦味氨基酸和寡肽分子量范围控制在500～3000da，经等电点沉淀法沉淀纯化后其含量应降至0.5%以下，优选为0.3%以下。

优选，步骤3）中等电点沉淀法ph4.0-5.0。

优选，最终得到的酪蛋白重均分子量mw应在10,000~30,000da，优选为15,000~25,000da。

进一步，本申请提供了所述的方法制备的酪蛋白。

进一步，本申请提供了所述的酪蛋白用于蛋白补铁类药物制备中的应用。

优选，所述应用中的蛋白补铁类药物为蛋白琥珀酸铁。

进一步，本申请还提供了一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，该方法包括以下的步骤：

1）称取所述的酪蛋白，加入碱使其溶解；

2）待蛋白完全溶解后，加入丁二酸酐，酰化后即得琥珀酸蛋白粗品，酪蛋白酰化程度应在80~100%，琥珀酰蛋白的络合常数k为0.93~1.87；

3）将琥珀酰蛋白粗品溶液加入盐酸缓慢酸化至ph2.0~4.5，等电点附近2.0~2.5沉淀，复溶，反复多次直至获得精制的琥珀酸蛋白；

4）精制的琥珀酰蛋白加入碱使其溶解，加入含三价铁离子的溶液，反应得到蛋白琥珀酸铁粗品；

5）蛋白琥珀酸铁粗品溶液加入盐酸缓慢酸化至ph2.0~4.5，等电点附近2.0~2.5沉淀，复溶，反复多次直至获得精制的蛋白琥珀酸铁；

6）通过合适方法干燥蛋白琥珀酸铁。

作为一种具体的实施方式，一种包含所述方法纯化后的酪蛋白的蛋白琥珀酸铁的制备方法，该方法包括以下的步骤：

1）称取一定量的酪蛋白，加入适量碱使其溶解；

2）待蛋白完全溶解后，加热至45℃，加入适量的丁二酸酐，加入适量碳酸钠溶液并维持ph8.0左右，酰化2~3h后即得琥珀酸蛋白粗品；

3）琥珀酰蛋白粗品溶液加入盐酸缓慢酸化至一定ph，析出白色沉淀，使用过滤的方式分离出沉淀物，沉淀物使用水洗和碳酸钠溶液复溶，再加入盐酸酸化至一定ph并析出白色沉淀，反复多次直至获得精制的琥珀酸蛋白；

4）精制的琥珀酰蛋白加入适量碱使其溶解，加热至45℃，向其中加入适量的三氯化铁，加入适量碱并维持ph8.0左右，反应3h，得到蛋白琥珀酸铁粗品；

5）蛋白琥珀酸铁粗品加入盐酸缓慢酸化至一定ph，析出白色沉淀，使用过滤的方式分离沉淀物，沉淀物使用水洗和碳酸钠溶液复溶，再加入盐酸酸化至一定ph并析出白色沉淀，反复多次直至获得精制的蛋白琥珀酸铁；

6）通过合适方法干燥蛋白琥珀酸铁。

优选，步骤1）和步骤4）中的碱包括氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾和碳酸氢钾中的一种或多种。

优选，步骤2）得到的琥珀酰蛋白的络合常数k为0.93~1.87，优选为1.12~1.75。

优选，步骤2）中的酪蛋白酰化程度应在80~100%，优选85~95%。

优选，步骤3）中加入盐酸缓慢酸化至ph2.0~4.5，优选等电点2.0~2.5附近，此条件下沉淀完全。

优选，步骤5）中加入盐酸缓慢酸化至ph2.0~4.5，优选等电点2.5~3.0附近，此条件下沉淀完全。

优选，步骤5）中得到的蛋白琥珀酸铁的黏度在浓度5%和温度25℃的条件下为10~20cp，优选为10~15cp。

优选，步骤6）中干燥蛋白琥珀酸铁的方法为喷雾干燥法、冷冻干燥法和喷雾冷冻干燥法，优选为喷雾干燥法，按此方法获得的蛋白琥珀酸铁其粒径为100~300nm，优选为150~250nm。

进一步，本申请提供了所述的方法制备的蛋白琥珀酸铁。

进一步，本申请提供了所述蛋白琥珀酸铁的制备方法在蛋白琥珀酸铁溶液制备中的应用。

本申请中采用α-凝乳蛋白酶水解酪蛋白。由于国外生产酪蛋白产品均以牛奶为原料，经纯化得到酪蛋白。纯化方式主要有酶水解、化学纯化（酸水解、碱水解）和物理纯化（加热、高压）。物理方式由于沉淀不完全，一般作为化学方式的辅助方式。由于碱纯化产物有异味，而酸纯化易使蛋白质变性，生成有毒物质，严重地损害蛋白的安全性，降解条件及产物的控制难度大，因此化学纯化只能作为初步的处理方式。与物流、化学纯化方式相比，酶解法生产条件温和、安全性高、成本低，水解条件易于控制，并且在特定条件下可进行定位水解产生特定的蛋白或多肽。另一方面，αs1-酪蛋白进入胃后，在凝乳酶及胃酸的作用下，容易在胃中形成不易消化的凝块，影响蛋白的消化吸收，并进而引起胃部不适、腹部胀气等。此外，β-乳球蛋白易引起婴儿的过敏反应。采用蛋白酶对牛乳蛋白进行适度酶解可以提高蛋白质的利用率，避免婴幼儿的不良反应。因此本发明使用的酪蛋白为采用物理化学方式初步纯化后采用酶水解后的酪蛋白。

能够水解酪蛋白的蛋白酶包括碱性蛋白酶（alcalase酶、胰蛋白酶）、酸性蛋白酶（胃蛋白酶、凝乳蛋白酶）和中性蛋白酶（木瓜蛋白酶）。碱性蛋白酶水解蛋白时易发生脱酰胺反应，使产品具有氨味或辛辣味。因此本发明使用的酪蛋白优选为酸性蛋白酶或中性蛋白酶水解后的酪蛋白。

研究表明，酪蛋白以胶团形式悬浮于水相体系中。对于胶团的外部形状，电镜观察显示，酪蛋白胶团呈粗糙的球形结构。“waugh模型”认为酪蛋白胶团呈现核-壳模式，并有亚胶团结构的存在，即由仅α和β-酪蛋白构成的亚胶团结构构成球核，外壳由κ-酪蛋白分子和磷酸丝氨酸残基（ca²⁺紧密结合）组成保护层。凝乳酶的主要作用是分解乳中酪蛋白的肽键，酪蛋胶粒表面酪蛋白层部分分解，形成假κ-酪蛋白和糖巨肽，使酪蛋白胶粒失去稳定性，在ca²⁺参与下使蛋白凝固，形成凝乳蛋白。采用α-凝乳蛋白酶分解乳蛋白，能使其产物苦味降低。

本申请中采用蛋白酶对牛乳蛋白进行酶解应适度，否则κ-酪蛋白层完全分解后，α和β-酪蛋白将继续分解，使得酪蛋白降解为多肽。研究表明α-酪蛋白酶解物的粒度分布越来越集中，粒径越来越小。酶解30min之内，β-酪蛋白酶解物中粒度分布变化不明显，κ-酪蛋白在前10min，粒度变化明显，之后和α-酪蛋白变化趋势类似。也就是说，为了达到服用避免胃部不适和在肠道快速释放出铁的目的，酪蛋白中αs1-和β-酪蛋白的比例不宜过高。

本申请中还采用氨肽酶和羧肽酶结合的方式，水解杂质蛋白或多肽。这是因为一般来说，蛋白或肽链中疏水性氨基酸残基越多，该物质的苦味就越可能强，含芳香侧链的氨基酸（苯丙氨酸phe、色氨酸trp、酪氨酸tyr）则能显著加强苦味。此外，一些碱性氨基酸残基如arg（精氨酸）也会造成苦味，尤其碱性氨基酸残基位于n-末端时，苦味更强。由于游离氨基酸、寡肽与蛋白、多肽相比，其苦味程度要小得多，因此采用外切蛋白酶（氨肽酶、羧肽酶）作用将利于水解产物生成游离氨基酸，疏水性氨基酸被外切酶从末端切掉，可使苦味减弱。氨肽酶可选择性从多肽和蛋白质n-末端水解释放氨基酸。羧肽酶能选择性对多肽和蛋白质c-末端水解释放氨基酸。

本申请采用了等电点沉淀法除去氨基酸和寡肽，因其在其等电点附近溶解度最低。即将蛋白水解物调至等电点附近，使得苦味和涩味物质水溶性降低，形成沉淀，然后离心或过滤除去。然而，杂质蛋白或多肽被水解后将产生的部分低分子量的氨基酸和寡肽，也是引起苦味和涩味的原因之一。但并不是所有的氨基酸和寡肽都具有苦味和涩味。另一方面，即使使用等电点沉淀法，仍不能将氨基酸和寡肽完全除去，故需要对具有苦味和涩味氨基酸和寡肽进行一定的控制，将其含量降至合适范围。最后，得到的酪蛋白应具有一定的分子量。过高的分子量意味着乳蛋白水解不完全，酪蛋白含量低，杂质蛋白含量高。过低的分子量意味着酪蛋白水解过度，生成较多多肽，而多肽难以形成蛋白琥珀酸铁的微观结构，达不到治疗效果。

本申请中三价铁与酪蛋白的结合取决于其本性(αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白)和铁的形式。据估计，每1个β-酪蛋白分子仅可以结合7个铁离子，其它几种结构的酪蛋白结合铁能力也很有限。通过对酪蛋白的琥珀酰化，可大大提高蛋白与铁的络合位点。然而，过高的络合常数意味着琥珀酰蛋白与铁结合紧密，不利于铁的释放；而过低的络合常数，意味着琥珀酰蛋白与铁结合不够紧密，与蛋白结合的铁的数量偏少，这意味着为了达到铁的有效剂量，需要增加蛋白琥珀酸铁的数量，这将造成制剂生产过程中溶解的可能性和推高成本；同时也蛋白琥珀酸铁储存过程中铁也容易分离出来，造成游离铁超标，降低药效。另一方面，络合常数k的存在也对酪蛋白的琥珀酰化程度提出了限制。过高的酰化率将提升蛋白与铁的结合率，意味着蛋白琥珀酸铁中铁含量上升，蛋白含量下降，这样增加了蛋白琥珀酸铁分子的不稳定性，容易造成蛋白膜破裂，部分铁释放使得游离铁超标，既影响药效，还影响口感。过低的酰化率将降低与蛋白结合的铁的数量，这意味着为了达到铁的有效剂量，需要增加蛋白琥珀酸铁的数量，这将造成制剂生产过程中溶解的可能性和推高成本。本申请采用邻苯二甲醛法测定酪蛋白酰化程度，由于琥珀酸为二元酸，因此酰化程度理论上可用超过100%。

本申请中的反应时间因为生产批量的扩大而有可能延长，因此不应对反应时间做出严格限制。且为了实现蛋白琥珀酸铁口服溶液生产工艺中过滤的步骤，蛋白琥珀酸铁必须具有较低的黏度。

本申请的有益效果在于：1）采用α-凝乳蛋白酶分解乳蛋白，能使其产物苦味和涩味降低；2）采用氨肽酶和羧肽酶结合的方式来水解杂质蛋白或多肽，除去带来不良风味的蛋白或多肽杂质，改善产品口感；3）合适的酪蛋白分子量可形成蛋白琥珀酸铁的微观结构，达到较好的治疗效果；4）通过对酪蛋白的琥珀酰化，适宜的酰化程度和络合常数k可大大提高蛋白与铁的络合位点，增加蛋白琥珀酸铁分子的稳定性，同时也利于铁的释放，降低成本并提高药效。

附图说明

图1：蛋白琥珀酸铁在不同介质中的释放。

图2：同比例蛋白组成的酪蛋白制成的蛋白琥珀酸铁的释放。

图3：蛋白琥珀酸铁的组成（gpc）。

图4：不同分子量的蛋白琥珀酸铁的释放。

图5：不同络合常数的蛋白琥珀酸铁的释放。

图6：不同黏度的蛋白琥珀酸铁的释放。

图7：不同粒径的蛋白琥珀酸铁的释放。

图8a、8b蛋白琥珀酸铁的粒径分布。

图9a蛋白琥珀酸铁冷冻干燥后（含20%甘露醇）的微观形态（sem），9b蛋白琥珀酸铁（溶液，1%）的微观形态（sem）。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1酪蛋白的提取和纯化

（1）取牛奶适量，冷却至4℃左右，3000r/min离心10min，除去上层脂肪层；

（2）下层乳液置烧杯内，加热至40℃左右，在搅拌下慢慢加入适量盐酸，调节ph至4.7左右，产生大量絮状物沉。冷却至室温，3000r/min离心10min，弃去上清液。

（3）沉淀物使用纯化水洗涤三次，3000r/min离心10min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。

（4）沉淀物捣碎，加入适量乙醇，搅拌后静置片刻，将悬浮液转移至布氏漏斗抽滤；滤饼继续捣碎，加入适量乙醚，搅拌后静置片刻，将悬浮液转移至布氏漏斗抽滤。

（5）上述滤饼捣碎，加入氢氧化钠溶解；然后慢慢加入盐酸，至产生沉淀后继续加入盐酸，直至ph至2.0左右，搅拌溶解，期间继续加入盐酸保持ph2.0左右；加热至45℃，加入α-凝乳蛋白酶（酶与底物比为0.3），水解40min；当水解度约为10%时，停止水解。按上述方法得到的酪蛋白组成αs1：αs2：β：κ≈3:4:3。

（6）上述酪蛋白溶液加入氢氧化钠调节ph至7.5~8.0，加热至45℃，加入氨肽酶和羧肽酶，水解60min，得到的酪蛋白其分子量在10,000~30,000da。

（7）上述酪蛋白水解物溶液加入适量盐酸，调至等电点附近（ph4.2），将水解产物氨基酸和寡肽（500～3000da）沉淀除去，最终其含量应低于0.3%。最终得到的酪蛋白其分子量应在10,000~30,000da。

实施例2蛋白琥珀酸铁的制备

（1）称取一定量的酪蛋白，加入适量碳酸钠溶液使其溶解。

（2）待蛋白完全溶解后，加热至45℃，加入适量的丁二酸酐，加入适量碳酸钠溶液并维持ph8.0左右，酰化2~3h后（酰化程度90%）即得琥珀酸蛋白粗品。

（3）琥珀酸蛋白粗品溶液加入盐酸缓慢酸化至ph2.2，析出白色沉淀，使用过滤的方式分离出沉淀物；沉淀物使用水洗和碳酸钠溶液复溶，再加入盐酸酸化至ph2.2并析出白色沉淀；反复多次直至获得精制的琥珀酸蛋白。

（4）精制的琥珀酸蛋白加入适量碳酸钠溶液使其溶解，加热至45℃，向其中加入适量的三氯化铁，加入适量碳酸钠溶液并维持ph8.0左右，反应3h，得到蛋白琥珀酸铁粗品；

（5）蛋白琥珀酸铁粗品加入盐酸缓慢酸化至至ph2.7，析出白色沉淀，使用过滤的方式分离沉淀物；沉淀物使用水洗和碳酸钠溶液复溶，再加入盐酸酸化至ph2.7并析出白色沉淀；反复多次直至获得精制的蛋白琥珀酸铁。

（6）采用喷雾干燥的方式干燥蛋白琥珀酸铁，干燥参数为：喷雾压力0.2mpa，进风温度120℃，出风温度90℃，进风风量25m3/h。

蛋白琥珀酸铁不被胃蛋白酶消化，却在中性ph值时可被胰蛋白酶水解。因此蛋白琥珀酸铁所含的铁受蛋白膜的保护而不和胃液中盐酸和胃蛋白酶发生反应而释放。随着蛋白琥珀酸铁进入肠道，由于ph值的升高使得蛋白琥珀酸铁重新变得可溶，并且使蛋白膜为胰蛋白酶所消化，蛋白琥珀酸铁所含的贴在十二指肠内开始释放，特别在空肠中释放。

实施例3蛋白琥珀酸铁的释放介质

根据本品的特殊性质，本品的释放度是区分产品的质量的重要标准。考察了蛋白琥珀酸铁在不同介质中的铁的释放情况（见附图1），溶出条件：桨法，50rpm，900ml介质。

其中蓝色曲线0~2h采用盐酸溶液（ph1.2），2~4h采用磷酸盐溶液（ph6.8），可以发现蛋白琥珀酸铁在该条件下几乎无释放。

更换考察条件，红色曲线0~2h采用人工胃液，2~4h采用人工肠液，可以发现蛋白琥珀酸铁在人工胃液中几乎无释放，在人工肠液中释放迅速。因此可采用人工肠液作为蛋白琥珀酸铁的释放介质。

实施例4蛋白琥珀酸铁的质量控制

4.1不同比例蛋白组成的酪蛋白制成的蛋白琥珀酸铁的释放度

考察了由不同比例蛋白组成的酪蛋白制成的蛋白琥珀酸铁的释放度（见图1）。随着αs1：αs2：β：κ组成比例的变化（αs1、β比例降低，αs2比例升高），释放速度逐渐加快。αs1：αs2：β组成比例在3:3:3至4:1:4时，释放速度比较合理，既不会释放过快造成铁来不及吸收，也不会释放过慢造成铁吸收量不足。另一方面，由于酪蛋白中αs1、β的初始比例就比较高，因此将其完全消除技术上难度很大，也没有必要。

根据图3，可以发现制得的蛋白琥珀酸铁主要含有3个成分。常规酪蛋白中κ-酪蛋白的比例大约为10%，且由于κ-酪蛋白处于最外层，酶解也最为迅速，因此实际获得的蛋白琥珀酸铁中并不含κ-酪蛋白。

上述结果证实了实施例1中获得酪蛋白组成中αs1-酪蛋白含量小于40%，优选小于30%；β-酪蛋白含量小于40%，优选小于30%。

4.2不同分子量的酪蛋白制成的蛋白琥珀酸铁的释放度

考察了不同分子量的酪蛋白制成蛋白琥珀酸铁的释放度（见图4）。从释放曲线可以发现过小的分子量制得的蛋白琥珀酸铁存在突释严重的现象，因为过低的分子量意味着酪蛋白水解过度，生成较多多肽，而多肽难以形成蛋白膜并将铁完全包裹起来。而过高的分子量制得的蛋白琥珀酸铁释放过于缓慢，因为高分子量意味着更大的粒径，而粒径越大，意味着铁被包埋得越深，因此越难释放。上述结果证实了实施例1中获得的酪蛋白分子量应在10,000~30,000da，优选为15,000~25,000da。

4.3不同络合常数的蛋白琥珀酸铁的释放度

考察了不同络合常数的酪蛋白制成蛋白琥珀酸铁的释放度（见图5）。从释放曲线可以发现过小的络合常数制得的蛋白琥珀酸铁存在释放缓慢的情况，因为越低的络合常数意味着越少的铁被包埋，造成这部分铁被包埋在蛋白深处，因此越难释放。而过高的络合常数制得的蛋白琥珀酸铁释放过快，并不利于吸收。上述结果证实了实施例2获得的蛋白琥珀酸铁络合常数k应为0.93~1.87，优选为1.12~1.75。

4.4不同黏度的蛋白琥珀酸铁的释放

考察了不同黏度的蛋白琥珀酸铁的释放度（见图6）。随着蛋白琥珀酸铁溶液黏度的增大，释放度急剧下降。较低黏度可实现蛋白琥珀酸铁口服溶液生产工艺中过滤的可能和保证铁的吸收。上述结果证实了实施例2获得的蛋白琥珀酸铁其溶液黏度（5%，25℃）应为10~20cp，优选为10~15cp。

4.5不同粒径的蛋白琥珀酸铁的释放

考察了不同黏度的蛋白琥珀酸铁的释放度（见图7）。过低粒径的蛋白琥珀酸铁释放过快，不利于铁的吸收。过大粒径的蛋白琥珀酸铁意味着铁被包埋在蛋白深处，因此越难释放。上述结果证实了实施例2获得的蛋白琥珀酸铁其溶液黏度（5%，25℃）应为其粒径为100~300nm，优选为150~250nm。

实施例5蛋白琥珀酸铁的微观结构

5.1蛋白琥珀酸铁的粒径分布

样品平均粒径在225nm左右（见图8a，8b）。样品在30nm，150nm和1000nm左右有峰；30nm处峰高很低，对产品质量影响较小，可以忽略。1000nm处峰较大，说明样品中存在较大粒径的颗粒，可能是由小粒子团聚而成。事实上，上述数据来源于由放置一段时间后的蛋白琥珀酸铁溶液。

然而，刚制得的蛋白琥珀酸铁其粒径在150~250nm，并无大粒子存在。这说明蛋白琥珀酸铁在溶液中容易聚合，因此本品在制得后应及时干燥，不应在溶液中久储。

5.2蛋白琥珀酸铁的微观形态

蛋白琥珀酸铁的微观形态（扫描电镜，sem）如图9。冷冻干燥后的蛋白琥珀酸铁显得更圆整一些（见图9a）。溶液中，蛋白琥珀酸铁呈胶束状态；部分胶束有粘连、聚合的现象，也证实了5.1粒径分布的正确性。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。