一株ARTP-NTG复合诱变苏云金芽胞杆菌突变株及其应用

一株artp
‑
ntg复合诱变苏云金芽胞杆菌突变株及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株苏云金芽胞杆菌，尤其是涉及一株artp
‑
ntg诱变苏云金芽胞杆菌突变株及其对小菜蛾/棉铃虫生物防治的应用。


背景技术：

2.苏云金芽胞杆菌（bacillus thuringiensis，bt）产生的杀虫晶体蛋白（icp）是一种生态友好型生物农药，对鳞翅目，鞘翅目等农业害虫具有高效特异的生物毒性，是目前使用最广泛的微生物杀虫剂之一。已有苏云金芽胞杆菌（bt）杀虫晶体蛋白基因已成功转入植物中，随着转基因品种增加和杀虫制剂的施用，昆虫对杀虫晶体蛋白的抗性将不可避免地增强。不断分离筛选新的高毒力bt新菌株是目前解决该问题最重要最可行的方法之一。
3.但是，目前通过传统的分子遗传改良手段和方法获得的苏云金芽胞杆菌突变株，对害虫的防治效果欠佳；且这些方法存在着效率低，操作复杂等缺点。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株对小菜蛾/棉铃虫生物防治效果好的artp
‑
ntg诱变苏云金芽胞杆菌突变株，且诱变方法操作简单，效率高。
5.本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株artp
‑
ntg诱变苏云金 芽胞杆菌突变株，为苏云金芽胞杆菌btx023pn(bacillus thuringiensisbtx023pn，简称btx023pn)，该菌种于2020年7月2日保藏于中国典型培 养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国武汉武汉大学)，菌种保藏号为cctccno：m2020264。
6.本发明之苏云金芽胞杆菌突变株x023pn的16s rdna序列为：agggcggggggggtgcctatacatgcagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataacattttgaactgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaaaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaa
ccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaaccttttggagccagccgccctaaggtggaccccgatgg即为agggcggggg gggtgcctat acatgcagtc gagcgaatgg attaagagct tgctcttatg 60aagttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccataagac tgggataact 120ccgggaaacc ggggctaata ccggataaca ttttgaactg catggttcga aattgaaagg 180cggcttcggc tgtcacttat ggatggaccc gcgtcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag 420ggaagaacaa gtgctagttg aataagctgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 480ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggaattat 540tgggcgtaaa gcgcgcgcag gtggtttctt aagtctgatg tgaaagccca cggctcaacc 600gtggagggtc attggaaact gggagacttg agtgcagaag aggaaagtgg aattccatgt 660gtagcggtga aatgcgtaga gatatggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctttctggtc 720tgtaactgac actgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgaagtt 840aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca aaggaattga 900cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960ccaggtcttg acatcctctg aaaaccctag agatagggct tctccttcgg gagcagagtg 1020acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080gagcgcaacc cttgatctta gttgccatca ttaagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200acacacgtgc tacaatggac ggtacaaaga gctgcaagac cgcgaggtgg agctaatctc 1260ataaaaccgt tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc 1320tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taaccttttg gagccagccg 1440ccctaaggtg gaccccgatg g 1461
室温常压等离子体（artp）诱变技术是一种新的物理诱变技术，尤其对于代谢途径复杂的生物体，其操作简单，能在最短时间内培育出突变株。研究表明，结合具有“超级诱变剂”之称的化学诱变剂亚硝基胍（ntg）进行化学诱变，可进一步提高突变的效率。
7.常压室温等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁，膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。亚硝基胍属于化学诱变剂中的烷化剂，细胞经ntg处理，可诱发gc
‑
at的转换，另外还可诱发dna小范围切除、移码突变及gc对缺失的突变发生。
8.本发明之artp
‑
ntg诱变苏云金芽胞杆菌突变株苏云金芽胞杆菌 x023pn（btx023pn），系采用artp二次诱变和ntg一次诱变对苏云金芽胞杆菌btx023进行诱变，经菌落形态观察、生物毒力测定，16s rdna基因同源性分析，得到。经鉴定为bacillus属，thuringiensis种，命名为苏云金芽胞杆菌x023pn（btx023pn）。
9.苏云金芽胞杆菌x023pn发酵菌液的制备：将苏云金芽胞杆菌x023pn接种到发酵培养基中, 26
‑
30℃，120
‑
180 rpm 发酵培养48
‑
52 h，即得苏云金芽胞杆菌x023pn发酵菌液。
10.所述发酵培养基的成分优选为：葡萄糖14
‑
17g/ l，蛋白胨12
‑
15 g/ l，kh2po4•
3h2o1.2
‑
1.6 g/ l，feso4•
7h2o 0.02
‑
0.03 g/ l，mnso4•
h2o 0.02
‑
0.03 g/ l，mgso4•
7h2o 0.25
‑
0.30g/ l，ph 6.8
‑
7.2。
11.杀虫活性检测：取苏云金芽胞杆菌x023pn发酵菌液对小菜蛾/棉铃虫进行毒性生测实验（具体方法参见“具体实施方式”部分的实施例）。
12.苏云金芽胞杆菌作为重要生防菌，其作用范围涵盖多种鳞翅目、鞘翅目农业害虫。本发明诱变得到的苏云金芽胞杆菌x023pn对鳞翅目靶标昆虫小菜蛾/棉铃虫的毒性较现有苏云金芽胞杆btx023更高，并提前6小时裂解，晶体蛋白产量增多。经试验，应用于对小菜蛾/棉铃虫的杀灭，对小菜蛾的杀虫活性提高2.3倍，对棉铃虫的杀虫活性提高1.3倍，差异显著。对农业作物害虫生物防治和农业生产具有重要的应用价值。
附图说明
13.图1 为本发明btx023pn菌株的16s rdna序列进化树；图2 为现有btx023菌株与本发明btx023pn菌株在发酵培养基中生长曲线测定结果图；图3为现有btx023菌株与本发明btx023pn菌株在发酵培养基中菌体形态相差显微镜观察图；图4为现有btx023菌株与本发明btx023pn菌株芽胞和晶体的冷场扫描电镜观察图；图5为现有btx023菌株与本发明btx023pn菌株晶体蛋白sds
‑
page检测图。
14.微生物菌株保藏情况说明苏云金芽胞杆菌btx023pn(bacillus thuringiensisbtx023pn)，该菌种于2020 年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国武汉武 汉大学)，菌种保藏号为cctcc no：m2020264。
g/ l，feso4•
7h2o 0.02
‑
0.03 g/ l，mnso4•
h2o 0.02
‑
0.03 g/ l，mgso4•
7h2o 0.25
‑
0.30g/ l，ph 6.8
‑
7.2。
24.④
本实施例之btx023和btx023pn在发酵培养基中生长曲线测定：具体实施过程：btx023和btx023pn以lb液体培养基过夜活化后，按照1%比例分别转接于发酵培养基继续培养，每组设置三个平行。每隔一定时间（2 h）取一定体积培养物，以新鲜发酵培养基作为空白对照，利用分光光度计测定 od
600
值（od
600
值在0.1
‑
1.0之间，若超过此数值，则进行适当稀释），以同步反应菌体生长密度。以培养时间为横坐标、培养物od
600
值为纵坐标绘制生长曲线。
25.图2为btx023和btx023pn在发酵培养基中的生长曲线测定结果图，显示btx023pn生长速度略快于btx023；且提前6 h 进入延滞期，但从32 h开始（稳定期后期），btx023pn菌株由于菌体的迅速裂解，导致培养物的od
600
值急剧下降，然而btx023的od
600
值在38 h 才开始下降。
26.⑤
本实施例之光学显微镜和冷场扫描电子显微镜观察：具体实施过程：取btx023和btx023pn发酵32 h的菌液1.5ml，9000rpm/min，3 min，离心，去上清，双蒸水清洗两遍，用200μl双蒸水重悬菌体，吸取10μl菌液滴于载玻片中央，盖上盖玻片，在100倍油镜下观察菌体的形态。btx023和btx023pn在发酵培养基中发酵48 h的菌液1.5ml，9000 rpm/min，3 min，离心，去上清，用生理盐水和5%的丙酮各清洗3次，pbs缓冲液洗涤6
‑
8次，最后用200 μl pbs缓冲液重悬菌体，洗涤后的沉淀加入2.5%的戊二醛固定液固定12 h，用无菌超纯水洗涤2次后，再依次用30%、50 %、70 %、80%、90%质量浓度梯度的乙醇脱水，每个梯度中需静置15 min，脱水完毕，用无水乙醇脱水2次，每次静置15 min，最后吸取混匀的样品
‑
乙醇悬浮液滴在覆有盖玻片的样品台上，在扫描电子显微镜下观察菌体形态。
27.图3是btx023和btx023pn的相差显微镜图。图4是btx023和btx023pn的冷场扫描电子显微镜图。
28.⑥
本实施例之杀虫活性测试：具体实施过程：btx023与btx023pn在lb培养基中活化12h后，以1%的接种量分别接种到发酵培养基中，分别培养60小时，52小时，收集发酵菌液。取一定量发酵菌液加入发酵培养基稀释，使其形成具有不同稀释浓度、总体系为300 μl的发酵菌液，将稀释后的发酵菌液加入30ml的人工饲料并充分混合，最终使其中发酵菌液被分别稀释为20、10、5、2.5、1.25
ꢀµ
l / ml五种浓度梯度。将30 ml的饲料平均加到3个平行的24孔生测板，即72个培养孔中，每个孔中添加一条小菜蛾/棉铃虫幼虫，共72条。在28
±
1℃的培养箱中喂饲，每12小时记录死虫的数量和总虫数，培养时间不超过96小时。记录数据通过spss软件的prohibit分析以计算不同条件下x023与x023pn发酵菌液的lc
50
（半致死浓度），使用lc
50
的非重叠95％置信区间作为确定毒性显着差异的标准。
29.表1 btx023与btx023pn的发酵菌液对小菜蛾的毒性lc
50
分析菌种名称小菜蛾lc
50
95%置信区间x0237.4216.272
‑
9.268x023pn3.1891.122
‑
4.711表2 btx023与btx023pn的发酵菌液对棉铃虫的毒性lc
50
分析
菌种名称棉铃虫lc
50
95%置信区间x02313.5749.173
‑
24.835x023pn10.2065.725
‑
18.404由表中结果可知，本发明之btx023pn突变株较野生菌btx023对小菜蛾/棉铃虫杀虫活性毒力有提高，差异较显著。
30.⑦
本实施例之btx023与btx023pn在发酵培养基的晶体蛋白提取及sds
‑
page检测。
31.（1）晶体蛋白的提取lb液体培养基过夜活化的btx023与btx023pn按1%的比例分别转接于50 ml发酵培养基，取相应时间点的发酵菌液，10000 rpm 4℃ 8 min离心收集菌体，弃尽培养基，沉淀用预冷的pbs清洗三遍，再用1m的nacl清洗两遍。用12 ml 0.9% nacl悬浮菌体，按照3 s、3 s、99次的设置参数冰浴超声两次破碎细胞，10000 rpm 4℃ 15 min离心，弃上清，用0.5% 丙酮溶液清洗两遍，期间用涡流振荡器去除芽胞，10000 rpm 4℃ 8 min离心收集晶体，
‑
80℃保存备用。
32.（2）蛋白含量测定采用bradford法对步骤（1）提取的晶体蛋白含量进行定量：取10 μl蛋白标准品（5 mg/ml bsa）用pbs溶液稀释至100 ul，使其终浓度为0.5 mg/ml；将稀释后标准品（0.5 mg/ml bsa）按0，1，2，4，8，12，16，20 μl分别加到96孔板中，加pbs溶液补足至20 μl；加适当体积样品到96孔板中，加pbs溶液稀释到20 μl，同时设置3个重复；各孔加入200 μl bradford染色液，轻轻用加样枪吹打均匀（注意不要弄出气泡影响读数）室温放置3
‑
5 min；用酶标仪测定a
595
波长的od值，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
33.（3）蛋白样品的sds
‑
page检测取步骤（2）提取的各晶体蛋白样品80 μl于一新的ep管中，各加入20 μl 5
×
sds
‑
page上样缓冲液，沸水浴10min后，12000r/min离心3min，混匀后点样进行sds
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page分析，点样体积按照上一步测得的蛋白浓度进行计算，每个孔的蛋白量统一为2 μg。电泳完毕后，sds
‑
page胶块用考马斯亮蓝染色液染色4h，然后用脱色液脱色至可看到清析明亮条带，用microtek bio
‑
5000蛋白胶扫描仪对实验结果进行扫描成像。
34.图5是btx023和btx023pn的晶体蛋白sds
‑
page检测图，图中m：蛋白maker, 1: btx023, 2: btx023pn。
35.结果显示：相较于位于菌株btx023，btx023pn在 130 kda 和65 kda 处的 cry 蛋白条带产量均有所增加。