抗IBDVVP2蛋白的单克隆抗体组合及其在鉴别检测IBDV中的用途的制作方法

本发明涉及一种单克隆抗体及其在病毒检测中的应用，特别涉及一种抗传染性法氏囊病病毒(ibdv)vp2蛋白的单克隆抗体组合及其在鉴别检测ibdv中的用途。本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术：

传染性法氏囊病(infectiousbursaldisease，ibd)是鸡的一种重要的免疫抑制病，其病原是传染性法氏囊病病毒(ibdv)。ibdv对养禽业的危害分直接危害和间接危害。直接危害：摧毁中枢免疫器官法氏囊，且能直接致死。间接危害：ibdv感染耐过的鸡免疫力低下，造成禽流感、新城疫等其它重要疫病的疫苗免疫失败，且易造成继发感染，影响鸡群生产性能，造成严重经济损失。总之，ibd严重影响养禽业的健康发展，其防控形势十分严峻。

ibdv的基因组由a、b两个节段组成。a节段全长约3200bp，编码多聚蛋白(pp，vp2-vp4-vp3)和vp5蛋白，pp进一步自剪切成熟为vp2、vp3、vp4。其中，vp2和vp3是ibdv重要的结构蛋白。vp2是组成病毒衣壳的重要成分，其位于病毒粒子的最外侧，是关键的宿主保护性抗原。b节段全长约2800bp，编码具有rna依赖的rna聚合酶活性的vp1蛋白，其在病毒基因的转录和翻译中发挥重要作用。

ibdv有两个血清型：血清i型和血清ii型。血清i型对鸡致病，血清ii型对鸡不致病。血清i型ibdv又分为经典毒、超强毒和变异株。上世纪90年代以来，以急性、高致死率为主要特征的ibdv超强毒(veryvirulentibdv,vvibdv)席卷全球，给养禽业造成了巨大损失。经近30年的努力，基于饲养管理水平的提高和疫苗的广泛使用等因素，vvibdv感染正逐渐被控制。然而，近年来ibd出现了新变化，ibdv变异株导致的非典型ibd成为养禽业新的威胁，该病直接摧毁中枢免疫器官法氏囊和b淋巴细胞，导致严重免疫抑制和生产性能下降，造成严重经济损失(范林进等，2019；fanetal,2019,2020；xuetal,2019)。

目前，ibdv经典毒、超强毒和变异株在流行病学上处于一个共存的状态。然而其鉴别检测只能依靠基因测序技术，需要特殊的技术和设备。

为此，本发明制备了分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并利用单克隆抗体介导的间接免疫荧光技术，建立了可鉴别检测ibdv变异株和非变异株(经典毒和超强毒)的方法，可鉴别检测ibdv变异株和非变异株(经典毒和超强毒)，因此，本发明的提出为ibdv的鉴别提供了新的技术手段，对于ibd的综合防控具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可用于鉴别检测ibdv的单克隆抗体，并建立相应的间接免疫荧光检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

首先，本发明提出了一种分泌抗传染性法氏囊病病毒(ibdv)vp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株组合，所述的杂交瘤细胞株组合由分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株7d以及25c组成，其中一株分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为7d，分类命名为分泌抗鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.21009，保藏时间为2020年11月5日；

另一株分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为25c，分类命名为分泌抗鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.21008，保藏时间为2020年11月5日。

其次，本发明还提出了一种抗传染性法氏囊病病毒(ibdv)vp2蛋白的单克隆抗体组合，所述的单克隆抗体组合由所述的抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株7d以及25c所分泌的单克隆抗体组成。

再次，本发明还提出了所述的单克隆抗体组合在制备鉴别检测传染性法氏囊病病毒的试剂中的用途。

其中，优选的，所述的传染性法氏囊病病毒包括传染性法氏囊经典毒、超强毒和变异株。

其中，优选的，传染性法氏囊经典毒包括ibd17jl01，genbank登录号：mn604241和mn604242、超强毒包括hlj0504，genbank登录号：gq451330和gq451331、变异株包括shg19，genbank登录号：mn393076和mn393077。

其中，优选的，使用所述的单克隆抗体组合通过间接免疫荧光检测，其中分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株7d对ibdv经典毒、超强毒和变异株均能识别；其中分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株25c只能识别ibdv经典毒和超强毒，不能识别ibdv变异株。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

传染性法氏囊病(infectiousbursaldisease，ibd)是鸡的一种重要的免疫抑制病。其病原包括ibdv经典毒、超强毒和变异株。本发明制备得到了两株分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株7d和25c，其中分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株7d对ibdv经典毒、超强毒和变异株均能识别，其中分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株25c只能识别ibdv经典毒和超强毒，不能识别ibdv变异株。此外，本发明还利用该两株单克隆抗体建立了间接免疫荧光技术，可鉴别检测ibdv变异株和非变异株(经典毒和超强毒)，对于ibd的综合防控具有重要意义。

附图说明

图1为间接免疫荧光检测结果(标尺为400um)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的制备

1.材料和方法

1.1病毒、细胞和小鼠

传染性法氏囊病病毒(ibdv)超强毒株gx株及其致弱株gt株、马立克氏病病毒(mdv)、j亚群禽白血病病毒(alv-j)、网状内皮组织增生症病毒(rev)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队(以下简称本实验室)鉴定和保存。sp2/0骨髓瘤细胞、df1细胞由本试验室保存。balb/c小鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2主要试剂与耗材

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚乙二醇(peg)、fitc标记荧光抗鼠二抗、亚类鉴定试剂盒为sigma产品；胎牛血清为ausbian产品；dmem为thermoscientific产品；hat、ht为invitrigen产品。恒温培养箱为thermoscientific公司产品；超净工作台为北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；倒置荧光显微镜为zeiss公司产品。

1.3免疫

取6周龄balb/c磁性小鼠，用纯化的ibdv超强毒株gx进行免疫。一免，将免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，经小鼠腹腔注射，剂量为100μg/只。间隔14d后进行二免，将佐剂换为弗氏不完全佐剂，免疫途径和剂量同一免。间隔14d后进行三免，免疫方法同二免。在进行细胞融合前3天，进行加强免疫，经小鼠尾静脉注射不加佐剂的免疫原，剂量为100μg/只。

1.4饲养细胞的制备

脱颈处死8周龄balb/c小鼠，浸泡于75％酒精中消毒10min。将其腹部向上固定于超净台中的解剖板上，剪开皮肤，暴露腹膜，用10ml注射器吸取5ml细胞培养液注入腹腔，按摩两侧腹部30秒后，用注射器回吸腹腔内液体。将该腹腔液体于1500rpm离心10min，弃上清。用hat培养液重悬细胞，分装于96孔细胞培养板中，100μl/孔(约10⁵个细胞)。置于37℃培养箱中培养。

1.5骨髓瘤细胞的制备

细胞融合前48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合时，将细胞吹散，1000rpm离心10min，弃上清。将细胞用dmem培养液重悬混匀，台盼兰染色计数，备用。

1.6免疫鼠的脾细胞准备

脱颈处死上述免疫过的balb/c小鼠，浸泡于75％酒精中消毒10min。无菌取出脾脏，放入已盛有l0mldmem培养液的平皿中清洗一次。将脾脏转入另一盛有10mldmem培养液的平皿中，注射器吸取平皿内的dmem培养液，注入小鼠脾脏，将脾细胞吹出。收集平皿内的脾细胞悬液于50ml离心管内，1000rpm离心10min，弃上清。将细胞重悬于10mldmem培养液，台盼兰染色计数，备用。

1.7细胞的融合

将上述制备的sp2/0细胞和小鼠脾细胞按照1:5～1:10的比例混合于50ml离心管，补加dmem培养液至40ml左右，轻轻混匀。27℃，1000rpm，水平离心10min，弃上清。将离心管于掌心轻击，使沉淀的细胞彻底松散均匀。将离心管置于37℃水浴保温；向离心管滴加预热的peg14501ml(要在1min左右加完，不能过快或过慢)；将离心管静置1min。向离心管内滴加预热dmem细胞培养液，最后定容至40ml。800rpm，室温离心10min左右，弃去上清。用50mlhat培养液重悬细胞，将之加入含有饲养细胞的细胞培养板，100μl/孔，于细胞培养箱中培养。5d后，用hat培养液换出50％培养液。7d后，用ht培养液换出hat培养液。10d时，吸取杂交瘤细胞上清，用ibdvvp2蛋白包被的elisa板(本实验室制备)检测其抗体效价。选择od450值最高且p/n最大的孔为阳性孔。

1.8融合细胞的亚克隆与筛选

采用有限稀释法对分泌抗体的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。将待克隆的杂交瘤细胞吹散成悬液，计数。以ht培养液稀释细胞，并加入96孔细胞培养板中，每孔100μl，即1.5个/孔。置于37℃恒温培养箱中培养5-8d。严格选取单个克隆的细胞孔，对其上清液进行抗体检测，取阳性克隆扩大培养。扩大培养后按上述方法进行下一次克隆至阳性率达100％。如此对杂交瘤细胞进行3次亚克隆。将经三次亚克隆仍呈现抗体阳性的细胞从96孔细胞培养板转置于24孔细胞培养板、6孔细胞培养板、细胞培养瓶进行逐步扩大培养。待细胞长满后同样的方法放入中培养，长满后转入细胞培养瓶扩大培养。一部分细胞进行冻存，另一部分细胞用于腹水的制备。

1.9单克隆抗体腹水的制备

取8周龄健康balb/c雄性小鼠3只，腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只，10-15d后使用。将处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞用pbs吹散制制成混悬液，注射入小鼠腹腔，将细胞数调至106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml(约5x10⁵个细胞)。一周后采集腹水，10000rpm离心l0min弃去上层的脂肪、石蜡油和下层的沉淀，小心抽去中层的淡黄色清亮液体，即为单抗腹水，于-20℃保存备用。

1.10单克隆抗体的鉴定

1.10.1单克隆抗体特异性鉴定

将ibdvgt株感染饲养于96孔板的df1细胞，24h后用待检抗体进行间接免疫荧光检测。同时设置马立克氏病病毒(mdv)、j亚群禽白血病病毒(alv-j)、网状内皮组织增生症病毒(rev)感染对照，以及未感染细胞对照。

1.10.2单克隆抗体效价测定

运用间接elisa测定单克隆抗体腹水的效价。具体判定标准为：阴性血清od值<0.2，阳性血清od值>1.0，检测样品od值>0.2，p/n>2.1时腹水的最大稀释倍数为腹水中抗体的elisa效价。

1.10.3单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定

采用sigma公司生产的抗体亚类鉴定试剂盒，对获得的单克隆抗体进行亚类鉴定。包被亚类鉴定试剂(羊抗鼠亚类抗体)每孔100μl，37℃1h。倒出孔内液体，用pbst洗涤3次，每孔加入100μl封闭液，37℃1h。倒出孔内液体，用pbst洗涤3次，每孔加入100μl待检样品，37℃1h。倒出孔内液体，用pbst洗涤3次，再加入hrp标记羊抗鼠igg，37℃30min，加底物显色。

2.结果

共获得10株能分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中两株命名为7d、25c，其分泌的单克隆抗体也与其相应细胞株同名。间接免疫荧光试验显示，所获得的单抗均特异性地识别ibdv。其腹水中抗体的elisa效价均不低于5.0×10⁶。单克隆抗体的亚类鉴定为igg1型、κ链。

其中，分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株7d保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.21009，保藏时间为2020年11月5日。

分泌抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株25c保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.21008，保藏时间为2020年11月5日。

实施例2单克隆抗体7d和25c对ibdv变异株的鉴别检测

1材料和方法

1.1单抗、细胞和病毒

抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体7d(cgmccno.21009)和25c(cgmccno.21008)由实施例1制备。鸡b淋巴细胞系dt40由本实验室保存。ibdv经典毒代表株ibd17jl01(genbank登录号：mn604241和mn604242)、超强毒代表株hlj0504(genbank登录号：gq451330和gq451331)、变异株代表株shg19(genbank登录号：mn393076和mn393077)均由本实验室分离鉴定。

1.2主要试剂、耗材与仪器

细胞培养液为含10％胎牛血清的dmem，细胞维持液为含2％胎牛血清的dmem。胎牛血清为ausbian产品；dmem为thermoscientific产品；fitc标记荧光抗鼠二抗为sigma产品。恒温培养箱为thermoscientific公司产品；超净工作台为北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；倒置荧光显微镜为zeiss公司产品。

1.3ibdv变异株的鉴别检测

用一对抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体7d和25c，基于间接免疫荧光技术，对ibdv经典毒代表株ibd17jl01、超强毒代表株hlj0504、变异株代表株shg19进行鉴别检测。具体操作步骤如下：

①将dt40细胞饲养于96孔板中。

②待细胞80％铺满孔底时，将200tcid50的ibdv经典毒代表株ibd17jl01、超强毒代表株hlj0504、变异株代表株shg19分别感染dt40细胞，各感染两个细胞孔。同时设置未感染病毒的细胞孔作为空白对照。

③在37℃细胞培养箱中孵育1h后，弃去接种的毒液，用pbs将细胞洗3次，更换细胞维持液。

④在37℃细胞培养箱中孵育24h后，弃掉细胞培养液，加适量4％多聚甲醛于室温固定细胞20min。

⑤弃掉多聚甲醛，用pbs将细胞洗3次，在感染相同病毒的两个孔中分别加入100ul稀释过的抗ibdv超强毒vp2蛋白单克隆抗体7d和25c，置于湿盒中37℃孵育1h。

⑥弃去单抗，用pbs将细胞洗3次，加入100ulfitc标记的抗鼠荧光二抗(1:200稀释)，置于湿盒中37℃避光孵育1h。

⑦弃去荧光二抗，用pbs将细胞洗3次，最后在每孔中加入100μl的pbs，于倒置荧光显微镜下观察。有绿色荧光信号的即为阳性孔。

2结果与讨论

间接免疫荧光检测结果显示，抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体7d对ibdv经典毒、超强毒和变异株均能识别；抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体25c只能识别ibdv经典毒和超强毒，不能识别ibdv变异株(图1)。除了这三株代表性毒株外，本研究还对其他毒株进行测试，均得到了相同结果。这说明，抗ibdvvp2蛋白单克隆抗体7d和25c联合使用，可鉴别ibdv变异株与非变异株。