本发明涉及重组胰岛素样生长因子i(rigf-1)的制造方法。
背景技术:
1、使用大肠杆菌的重组蛋白质的生产存在所表达的蛋白质的不溶化和错误折叠的问题。关于重组胰岛素样生长因子i(rigf-1),为了应对不溶化的问题,报告了使rigf-1表达为与泛素样蛋白sumo(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(sumo-rigf-1)的技术(参照非专利文献1)。另外,为了将正确折叠的rigf-1与错误折叠的rigf-1分离,使用反相高效液相色谱(hplc)(参照专利文献1)。
2、在非专利文献1中记载的通过sumo-rigf-1的表达生产rigf-1时,利用镍柱(ni-nta树脂柱)进行rigf-1的纯化。具体而言,将利用sumo蛋白酶对所表达的sumo-rigf-1进行处理而得的溶液(含有sumo-rigf-1、sumo蛋白酶、sumo和rigf-1)应用于ni-nta(镍-次氮基三乙酸)亲和色谱,使具有组氨酸标签的sumo-rigf-1、sumo蛋白酶和sumo吸附于柱,仅使rigf-1洗脱,由此对rigf-1进行纯化。
3、现有技术文献
4、专利文献
5、专利文献1:日本特表平07-501704号公报
6、非专利文献
7、非专利文献1:“soluble expression of human insulin-like growth factor-1with theassistance of sumo fusion partner”,journal of chemical andpharmaceutical research,2014,6(4):1059-1066
技术实现思路
1、本发明的主要目的在于提供一种用于相对于错误折叠的rigf-1以高纯度获得正确折叠的rigf-1的得到改善的方法。
2、为了解决上述课题,本发明提供以下的[1]-[11]。
3、[1]一种重组胰岛素样生长因子i(rigf-1)的制造方法,包括如下的工序:
4、(1)将rigf-1作为与泛素样蛋白sumo(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(sumo-igf-1)而获得的工序,
5、(2)利用sumo蛋白酶对sumo-igf-1进行处理的工序,
6、(3)将工序(2)的处理液应用于阳离子交换色谱,通过梯度洗脱得到含有rigf-1的洗脱液的工序。
7、[2]根据[1]的制造方法,其中,上述梯度洗脱包括:
8、(i)用盐浓度200mm以上且小于300mm的洗脱液进行的1柱容积以上的洗脱工序,
9、(ii)用盐浓度300mm以上且小于500mm的洗脱液进行的1柱容积以上的洗脱工序,
10、(iii)用盐浓度500mm以上的洗脱液进行的洗脱工序,
11、将rigf-1回收到上述洗脱工序(ii)的洗脱液中。
12、[3]根据[2]的制造方法,其中,洗脱工序(i)的洗脱条件如下。
13、以盐浓度200mm进行1.5-6柱容积(cv)的洗脱,接着以盐浓度250mm进行3-12cv的洗脱,进一步以盐浓度250mm~300mm的线性浓度梯度进行1.5-3cv的洗脱。
14、[4]洗脱工序(ii)
15、以盐浓度300mm进行1.5-6cv的洗脱,接着以盐浓度300mm~400mm的线性浓度梯度进行1.5-3cv的洗脱。
16、[5]根据[2]-[4]中任一项的制造方法,其中,洗脱工序(iii)的洗脱条件如下。
17、以盐浓度1m进行1.5-6cv的洗脱。
18、[6]根据[1]-[5]中任一项的制造方法,其中,工序(1)包括:使表达sumo-igf-1的宿主细胞溶解而得到第1试样溶液的工序(1-1)、以及将第1试样溶液应用于ni-nta(镍-次氮基三乙酸)亲和色谱而得到含有sumo-igf-1的第1洗脱液的工序(1-2),
19、工序(2)是利用sumo蛋白酶对上述第1洗脱液进行处理而得到含有sumo-igf-1、sumo蛋白酶、sumo和rigf-1的第2试样溶液的工序,
20、工序(3)是将第2试样溶液应用于阳离子交换色谱,通过梯度洗脱从sumo-igf-1、sumo蛋白酶和sumo中分离出rigf-1而得到含有rigf-1的第3试样溶液的工序。
21、[7]根据[1]-[6]中任一项的制造方法,其中,在工序(2)之后的阶段不包括利用ni-nta亲和色谱进行的分离工序。
22、[8]根据[1]-[7]中任一项的制造方法,其中,不包括利用反相高效液相色谱进行的错误折叠蛋白质的分离工序。
23、[9]根据[1]-[8]中任一项的制造方法,其中,在上述第3试样溶液中,蛋白质总量中所占的正确折叠的rigf-1量的比率为60%以上,优选为70%以上,更优选为80%以上,进一步优选为90%以上,特别优选为95%以上。
24、[10]根据[1]-[9]中任一项的制造方法,其中,上述宿主细胞为大肠杆菌。
25、[11]一种纯化方法,是重组胰岛素样生长因子i(rigf-1)的纯化方法,包括如下的工序:
26、(1)将rigf-1作为与泛素样蛋白sumo(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(sumo-igf-1)而获得的工序,
27、(2)利用sumo蛋白酶对sumo-igf-1进行处理的工序,
28、(3)将工序(2)的处理液应用于阳离子交换色谱,通过梯度洗脱得到含有rigf-1的洗脱液的工序。
29、本发明中“梯度洗脱”是指盐浓度梯度洗脱。梯度洗脱只要一部分包括使盐浓度发生线性(liner)或阶段性(stepwise)变化而进行洗脱的工序即可,无需在其全部工序中进行盐浓度变化的洗脱。即,梯度洗脱的一部分可以包括使盐浓度恒定进行洗脱的工序。
30、根据本发明,提供一种用于相对于错误折叠的rigf-1以高纯度获得正确折叠的rigf-1的得到改善的方法。
1.一种重组胰岛素样生长因子i即rigf-1的制造方法,包括如下的工序:
2.根据权利要求1所述的制造方法,其中,所述梯度洗脱包括:
3.根据权利要求1或2所述的制造方法,其中,工序(1)包括:使表达sumo-igf-1的宿主细胞溶解而得到第1试样溶液的工序(1-1)、以及将第1试样溶液应用于ni-nta亲和色谱即镍-次氮基三乙酸亲和色谱而得到含有sumo-igf-1的第1洗脱液的工序(1-2),
4.根据权利要求1~3中任一项所述的制造方法,其中,在工序(2)之后的阶段不包括利用ni-nta亲和色谱进行的分离工序。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的制造方法,其中,不包括利用反相高效液相色谱进行的错误折叠蛋白质的分离工序。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的制造方法,其中,在所述第3试样溶液中,蛋白质总量中所占的正确折叠的rigf-1量的比率为60%以上,优选为70%以上,更优选为80%以上,进一步优选为90%以上,特别优选为95%以上。