一株宽裂解谱沙门氏菌噬菌体RDP-NSA-19050及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一株宽裂解谱沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050及其在禽类动物致病性沙门氏菌感染中的应用。
背景技术：
：沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一,是一种常见的食源性致病菌。鸡是沙门氏菌最重要的宿主，沙门氏菌可引起鸡急性或慢性疾病，感染沙门氏菌的鸡也可通过产出带菌的蛋导致沙门菌的垂直传播，从而形成恶性循环。当鸡群暴发沙门氏菌病时死亡率可达80％，对养禽业造成巨大的经济损失。人一旦摄入了含有大量沙门氏菌的动物性食品，可导致食源性中毒，据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。抗生素一直以来被作为治疗细菌感染的首选而得到广泛应用。但随着抗生素的广泛使用甚至滥用，目前细菌对抗生素的耐药性问题已十分严重，抗生素耐药性正在对全球健康构成威胁。噬菌体(bacteriophage或phage)是自然界中最丰富的生物之一，在地球上大约蕴藏着1031的噬菌体颗粒，也就是平均每1g土壤或水中包含了多达108数量的噬菌体。长期以来，其一直被认为可作为治疗药物和杀菌剂使用。噬菌体对某些细菌菌株具有高度特异性，其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性，不会影响生物体或内源性组织的正常运转。另外，即使随着细菌耐药性的发展，噬菌体仍会大量保持。在过去几年中，使用噬菌体来检测和控制食品和环境中致病菌及腐败菌的生长受到越来越多研究者的关注，并且该方法已有许多研究支持。bmvkolyu等讨论了噬菌体检测致病菌的优缺点，指出利用噬菌体检测食品安全及加工制造过程等方面存在的致病菌具有极大的应用前景。例如在蜜瓜切片、鸡胸肉、白菜、牛奶、鸡皮、豆芽菜等食品中发现使用噬菌体制剂后沙门氏菌菌量显著减少。另外，已从多种食物如碎牛肉、猪肉等肉制品、奶制品、生菜等分离出沙门氏菌噬菌体，因此，噬菌体是食品中的天然微生物。本试验从现代化肉鸡养殖场采集粪便、污水和肝脏等样品，筛选能裂解多株病原菌的宽噬菌谱沙门氏菌烈性噬菌体，并对其生物学特性进行分析，以期为噬菌体防制沙门氏菌的研究提供理论依据。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株宽裂解谱沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050，旨在解决养殖场禽类因感染沙门氏菌，发病急而治疗不及时，且因致病菌耐药性而导致用药无效等问题。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一株宽裂解谱沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050，透过电镜观察，该噬菌体头部为二十面体，长径约60nm，横径约70nm，尾长约100nm，直径约10nm，为有尾病毒目肌尾病毒科；基因全长87591bp，不具有毒力基因和溶原基因，该噬菌体于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmccno.21415。进一步地，该噬菌体在ph在5-9范围内作用1小时，其效价在1×1010pfu/ml之上，适宜生长在中性环境中；在ph＝12以及ph＝2时，仍有噬菌体存活，该噬菌体的酸碱耐受范围宽。进一步地，该噬菌体在35℃-60℃内活性保持稳定，效价在1010.5pfu/ml以上，在90℃高温条件下作用30min，依然具有生物活性，对温度有较好的耐受性。进一步地，该噬菌体rdp-nsa-19050高效感染变形杆菌，其最佳感染复数为1：10。本发明还提供了沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的药物中的用途。本发明还提供了沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的饲料中的用途。本发明还提供了一种用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，包括有效量的如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050。进一步地，还包括用于抗沙门氏菌的抗生素。本发明还提供了一种预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的添加剂，其有效成分包括沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050。一种清洁剂或消毒剂，包括本发明沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050。本发明的有益效果体现在：(1)本发明从青岛即墨田横肉鸡养殖场一发病白羽肉鸡肝脏内分离得沙门氏菌nks-50，并通过实验确定了nks-50的致病性和耐药性，以nks-50为宿主，从环境中分离得到一株宽裂解谱沙门氏菌噬菌体，该噬菌体rdp-nsa-19050对禽类养殖环境中致病性沙门氏菌nks-50具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于禽类养殖环境中致病性沙门氏菌nks-50的防治提供了噬菌体来源；(2)本发明所提供的沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050的裂解谱广，能裂解包括斯坦利沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肯坦基沙门氏菌在内的致病菌，并具有裂解率高的特点，能裂解具有耐药性的沙门氏菌；在治疗沙门氏菌感染疾病具有很好的优势，效价较高，防治效果好。(3)本发明所提供的沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050在防控禽类致病性沙门氏菌中具有良好的应用前景。附图说明本发明上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：图1为本发明噬菌体rdp-nsa-19050的电镜图；图2为本发明噬菌体rdp-nsa-19050一步生产曲线的示意图；图3为本发明噬菌体rdp-nsa-19050酸碱稳定性实验的示意图；图4为本发明噬菌体rdp-nsa-19050对宿主菌nks-50的裂解试验示意图；图5为本发明噬菌体rdp-nsa-19050热稳定性实验的示意图；图6为本发明噬菌体rdp-nsa-19050遗传稳定性试验的示意图；图7为本发明噬菌体rdp-nsa-19050入血试验的示意图；具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1病原菌及噬菌体的分离及鉴定(1)致病性沙门氏菌nks-50的分离及其鉴定从青岛即墨田横肉鸡养殖场一发病白羽肉鸡中采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基(ss琼脂)上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润、黑色中心边缘透明的菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mllb肉汤中，37℃200rpm振荡培养6h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16srna分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性沙门氏菌，将其命名为nks-50，保存于-80℃冰箱。(2)噬菌体分离及鉴定粪便处理：称取5g养殖场采集到的粪便，加入10ml无菌水中浸泡过夜，10000rpm，5min离心浸出液，再用0.22μm滤器过滤上清液，收集滤液备用。制备混合菌悬液：取1ml菌悬液和2ml滤出液加入27mllb肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，收集滤液备用。噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1ml和沙门氏菌菌悬液0.1ml混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，观察结果，如果有噬菌体，那么平板上会有透明斑。挑取透明斑于1ml生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1ml浸出液和0.1ml菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化2-3次，至噬菌斑大小均匀为止。得到一株噬菌体，并将其命名为rdp-nsa-19050。rdp-nsa-19050在双平板形成的噬菌斑直径在4mm-5mm。(3)噬菌体的保藏将噬菌体增殖液与60％的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。实施例2噬菌体的电镜观察取20μl含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(pta)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态。由图1可知，该噬菌体头部为二十面体，长径约60nm，横径约70nm，尾长约100nm，直径约10nm；根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，将该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。实施例3最佳感染复数的测定按照感染复数为10:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000的比例将噬菌体增殖液和宿主加入lb肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。结果如表1所示。表1由表1数据可知，当感染复数为1:10时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明rdp-nsa-19050的最佳感染复数为1:10。实施例4一步生长曲线的测定取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌nks-50和噬菌体rdp-nsa-19050，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用lb肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的lb肉汤培养基中，迅速置于37℃200r/min的摇床中振荡培养并计时。前30min每隔5min取样计数，30-60min每隔20min计数，60-300min每隔30min计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。其中，平均裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。由图2可知，噬菌体感染宿主菌后的40min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约40min，感染后40-90min内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为50min。通过计算，噬菌体裂解量约为256pfu/感染细胞，表明噬菌体具有极强的裂解和复制能力。实施例5噬菌体ph稳定性的测定用稀盐酸和稀naoh溶液调节生理盐水的酸碱度，配成ph值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1*1010pfu/ml，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板。37℃倒置培养4-6h后计数由图3可知，噬菌体rdp-nsa-19050在ph5.0-9.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在ph为7.0时，噬菌体效价最高，表明该噬菌体最适生长ph为中性环境。随着ph值的升高或降低，噬菌体的滴度下降明显。表明噬菌体rdp-nsa-19050能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。实施例6噬菌体对宿主裂解曲线的测定将培养6h的宿主菌悬液以1:100的比例接种到100mllb培养基中，37℃200rpm振荡培养2h(od约0.45，约6.0*108cfu/ml)将菌悬液分装在4个灭菌的锥形瓶中，以最佳感染复数，向其中3个加入噬菌体增殖液0.2ml(约4.0*1011pfu/ml，经0.22μm膜过滤)，同时以不加噬菌体的作为对照，取其平均值。由图4可知，沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050加入到宿主菌nks-50菌悬液中，作用1h后出现一定的裂解效果，约2h，od600值开始下降，持续作用至12h，12h后混合菌液开始变得浑浊，od值逐渐升高。由于前30分钟，噬菌体处于对宿主菌的吸附、侵染阶段，只有少部分噬菌体开始裂解宿主，因此，其裂解宿主的量远远小于宿主的增长量，因此，od600在在前1h内，依旧保持一定的上升趋势，伴随着噬菌体数量的指数增加，在1h后，其裂解宿主数量大于宿主的增殖速度，所以od600值开始逐渐降低，混合菌液达最澄清。持续作用12小时后，混合菌液出现返浊，原敏感菌被噬菌体裂解，被突变的耐受菌所取代的一种菌群交替。实施例7：噬菌体热稳定性的测定将噬菌体原液分装到ep管中，分别在35℃，40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃和90℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍比稀释后，铺双平板测定其效价。由图5可知，噬菌体在35℃～60℃内活性保持稳定，在90℃作用30min，依然具有生物活性，表明该噬菌体对高温耐受性较好，适合在较高的温度下生存。实施例8：稳定性遗传实验将rdp-nsa-19050连续传代29次，每代培养基中加入等量的rdp-nsa-19050和nks-50，每代培养时间6h，然后铺双平板，测定其效价。由图6可知，将rdp-nsa-19050连续传29代后，其效价稳定在1012pfu/ml以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。实施例9：裂解率实验无菌条件下，分别取1ml样品和1ml宿主菌菌液(1×106cfu/ml)，37℃孵育15分钟，混匀后用生理盐水稀释至10-1-10-3个梯度，每个梯度取100μl涂布于lb琼脂平板上，置于37℃，培养24小时，每个梯度重复两次。同时取1ml生理盐水和1ml宿主菌菌液(1×106cfu/ml)作为空白对照，重复以上步骤。选取30-300个菌落数的平板进行计数。该试验重复3次，取其平均值。噬菌体裂解率＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％。由实验结果可知，rdp-nsa-19050的裂解率达98.8％，对宿主有较好的裂解效果，适合在养殖过程中使用。实施例10：rtd实验在平板上划分区域，在每一区域中心处滴加一滴宿主菌(约10μl)，晾干，将不同稀释度的一滴噬菌体液滴加到宿主菌的斑点上，晾干，37℃培养16-24h。根据宿主菌生长状况，凡是不能连片生长的，称为cl浓度(cl浓度是可以完全性裂解环境中宿主菌的浓度，可以用于指导生产实践的稀释方案)。由实验可知，rdp-nsa-19050在稀释107倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。实施例11：噬菌体入血实验在口服6h后，用pcr的方法进行噬菌体的检测，结果由图7可知，噬菌体在心、肝、肺、肾、胸腺和血清均能检测到，说明该噬菌体可以通过口服进入血液，通过血液循环到达心、肝、肺、肾和胸腺。实施例12噬菌体动物实验选择高致病性沙门氏菌nks-50，稀释100倍后，注射0.1ml，建立动物模型，初始60只鸡，造模成功后，剩余40只鸡，随机分成4组。选择噬菌体作为实验对象；设定阴性对照与阳性对照，分别记录鸡群生长状况，具体分组如表2所示。表2实验开始时，肉鸡为15日龄。给药10天之后，对不同组的肉鸡进行解剖。阴性对照组包心包肝现象明显，气囊有许多干酪样物；阳性对照组2(强力霉素)经饲喂后气囊清亮，没有浑浊，也没有包心包肝现象，噬菌体组(rdp-nsa-19050)、阳性对照组1(硫酸链霉素)包心包肝现象不明显，气囊症状明显减轻，气囊基本明亮，基本无浑浊。通过以上数据可以得出：本发明噬菌体rdp-nsa-19050可以用于沙门氏菌nks-50引起的气囊炎的治疗。实施例13：裂解谱实验选择实验室已鉴定好的31株沙门氏菌(5株鼠伤寒沙门氏菌、4株鸡白痢沙门氏菌、4株斯坦利沙门氏菌、1株甲型副伤寒沙门氏菌、1株乙型副伤寒沙门氏菌、1株伤寒沙门氏菌、7株肠炎沙门氏菌、1株汤卜逊沙门氏菌、2株山夫登堡沙门氏菌、4株肯坦基沙门氏菌)和沙门氏菌nks-50，进行裂解谱实验。具体结果如表3所示。表3由表3可知，本发明噬菌体rdp-nsa-19050在5株鼠伤寒沙门氏菌、4株鸡白痢沙门氏菌、4株斯坦利沙门氏菌、1株甲型副伤寒沙门氏菌、1株乙型副伤寒沙门氏菌、1株伤寒沙门氏菌、7株肠炎沙门氏菌、4株肯坦基沙门氏菌和沙门氏菌nks-50平板上均能形成噬菌斑，说明噬菌体rdp-nsa-19050宿主谱较为广泛，对肉鸡养殖中常见的沙门氏菌均能裂解，具有非常广泛的应用前景。实施例14噬菌体与抗生素复配使用噬菌体和头孢曲松钠都采用口服的方式，实验以7日龄发病白羽肉鸡为试验对象，每棚3万只鸡，实验分为4组，具体分组如下表4所示。表4分组给药备注一组噬菌体二组噬菌体+头孢噻肟钠(减半)三组噬菌体+头孢噻肟钠四组头孢噻肟钠注：噬菌体效价1.6*1012pfu/ml，用法用量：每升对应20000只鸡，集中饮水，2-3h。用药后，连续7天观察鸡群状况，并统计每天的死亡率，结果如表5所示。表5分组鸡群状态7日平均死亡率(％)一组正常0.076二组正常0.061三组正常0.053四组正常0.079通过以上表格可以看出，4个实验组鸡群精神状态都正常，死亡率相差不大，说明噬菌体在治疗方面有着和头孢噻肟钠一样的效果。噬菌体和头孢噻肟钠混合使用的两组，死亡率较低，且在头孢噻肟钠用量减半的情况下，效果也优于单独使用头孢噻肟钠的实验组，说明噬菌体和头孢噻肟钠复合使用可以增强治疗效果。综上，噬菌体和头孢噻肟钠复配使用，在保证治疗效果的前提下，可以有效减少头孢噻肟钠的使用量。噬菌体的合理使用，可以降低抗生素在畜牧养殖中的使用量，减少耐药菌的出现，保证食品健康安全，同时提高养殖效益。应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。序列表<110>瑞科盟（青岛）生物工程有限公司<120>一株宽裂解谱沙门氏菌噬菌体rdp-nsa-19050及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>87591<212>dna<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum<400>1atgtcacaatatattcctgttcctgatacagagtggtctacacaaactgtaactctggat60ggtactgtttttataattgagttaaagtataaagagaggcttgacagatggttcttgacg120ctatctgatgttgatggtaatgtattattatctgaaaagaaatgccttgcagaccagtca180atcacaggacgctatgtaattccttcattagctggagagctttttgttgaacgaatgtat240ggtactgatttacaacctaccagaaataatttcggaagagaaagggcatttgagcttaat300tattacactcaagaagatatgagattaatggagaatttataatgtctgtaaaagatagca360ctgctggggcttcttttaggtgctatcaattggctgtaggtagtgaaactacagccttta420atgataaacctacaagccatgccaaagattctatgcaaatggactatttcgacaacttac480aattcacttgtaacgtgtcttatacgtctcagaaaaataaagtaacctccgatgacacca540cttttgaaatctacaacctaaataaagagatgagagccaaatttaaaacagttggtgcaa600cagttatgctcagagcaggttacaccactggctttaaaagagacgcaaatggtgacctta660ttattgagtatgacaacctcccattaatttatctaggaactattgaatatgcttatacat720ataagcgtggtgttgatatggttacaaaggtcatctgttccaatgataaaatggaaagaa780ccacgattaagacatcaatctcttataaagcaggtacaacacgtaagagtgtaattagag840atttagtcaatagattaggcttctcacttattgatgaagacctttcaagtattgatggtt900acacttacaagaatggttttagtgtttggggaagtgttgcagaggcacttacaaaggttt960gtgaagaaagtagtctacgttggtatacatttaacaagcaaatcagagtagtccctttta1020acgctaaggctagacaactttcttgggaaatttacccgtataatgttattgattctttgc1080aaggttactacagaagaactagaaaggttctgaaaaaagagaataagacagttattaaag1140ttaaaactggagttcgttgcaaaatccatttagacgggagaattaagatgggtgatagtg1200tcacaattagagaaagtgaagattttgaaggtcagtatcgagtaaaaggtctttctcata1260atcttgactttactggtggtgcttggacaactgaactagatttagagaaggtggaataat1320gaagtcaccagttactagaatgtctgggtatgtttcagaatgtcttgatgaatttagaaa1380agaactgtatactggcttaccagctattatccagtcttttgattcaaagactcaaacagc1440cactgttaagccactttactctattaacggtttacctatgccagagattactggtgttcc1500tgttcaatttccaagtggtggtggcgcatctttaacattccctgtaaaaactaatgacag1560atgctggctagctttctcaatgttacctttagatgacttcgttgtcaatgacaagaatac1620tcagatggaaacaaatatgagaaggacacacgatatctcagactgtgtagctttcgtagg1680catctgcacaagaacacagaattttaaaccagacccaacagcagtcagacttcatttcgg1740tgactctgtgttaagagttacagatgatggcaatttttattttgaaggtgatgtacacat1800ttctaaaaacttgtacgtaacagaagaagtacatggttcagattttatcagtgacacgac1860tggtgtgagctttaatgaacacacgcaccattattactggacagaccctgctggtgaggc1920tgatactacagaggcacaataatgaaaacagattttgcattaaatctaggtggtgactat1980gttgccactttaggttcagattcagtgtatgtggctcatggtgatttaaagattactggt2040aaccaaattagaattatcccagaagatgataaagctactcaggttgctcaaagacttcat2100atcagatgccttttaagggctggtgaagtcttctttaacacatctgctggattcccatat2160ttacaacttgccaaatttaaacagaaaacttctatctttgataattatatgaaagcttac2220cttgttgaaacaagagatgtatccaatatctataactactcgtcttcaatggacaatgct2280caaagaaaagtaactgttaattttgatgcaactactacaacagatattttaacagacatt2340acgcaagaggttaatatctaatggcaggattaactacaacaggattacaaactctaagat2400atcaggaaatttttgataatattaaatcaagacttcttagagatatttcaccaaaccttg2460acgtttctgaagatagtcaattaggtctctttctggcttcaattgcaaggtctttagcag2520acacccatgaagtcctgtcagaaatttatgatggtgggacgattgataaagcggaaggtt2580ttaacctcg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