本发明属于微生物气溶胶采样技术领域，涉及一种病毒气溶胶分级采样方法。
背景技术：
一些可经呼吸道传播的病毒极易产生气溶胶，例如流感病毒、口蹄疫病毒以及2019年新型冠状病毒等。气溶胶暴露感染也成为了这些病毒的重要感染途径之一。因此，在传染病疫情爆发情境下，有极大的病毒气溶胶采样需求，然而目前市面上的病毒气溶胶采样器只能用于测定病毒气溶胶浓度，而无法测定其粒径分布特征。
六级撞击式空气微生物采样器是一个多孔、层叠碰撞(空气)采样器，通常用于环境中的需氧细菌和真菌浓度及其粒径分布的测量，被广泛用作统计微生物气溶胶中有活力微生物数目的标准仪器。六级撞击微生物采样器按照空气动力学原理设计，由六个铝盘组成，每个撞击盘具有直径和数量经过严格设计的加速喷射小孔。该采样器可以根据人体肺部的沉积情况采集所有微粒，无论物理尺寸、形状或密度。采样器的每级中可放置一个装有琼脂培养基的培养皿，用于收集采样空气中的微生物粒子，微生物粒子会随气流的撞击留在培养基上。采样结束后，可以将培养皿取出，进行培养，用菌落计计数器计数。目前，六级撞击式空气微生物采样器的缺点是无法进行病毒采样。
技术实现要素：
本发明是将六级撞击式采样器采样方法进行改进，使其实现病毒气溶胶的分级采样；采样后样品为可溶凝胶膜，可用少量液体溶解，达到病毒气溶胶浓缩富集的作用，可提高检测灵敏度；溶解后的样品可进行核酸提取用于pcr检测，或者孵育细胞进行病毒培养。
本发明采用的技术方案为：
一种病毒气溶胶分级采样方法，包括步骤如下：
步骤1，六级撞击式采样器中，每级采样器的收集板从下到上依次设置为琼脂层、孔径为0.05μm的核孔滤膜和可溶凝胶膜；
步骤2，当六级撞击式采样器以28.3l/min的流速运行时，气溶胶颗粒将根据粒径筛分为六级，第一级收集粒径大于7μm的颗粒，第二级收集粒径为4.7μm-7μm的颗粒，第三级收集粒径为3.3μm-4.7μm的颗粒，第四级收集粒径2.1μm-3.3μm的颗粒，第五级收集粒径1.1μm-2.1μm的颗粒，第六级收集粒径为0.65μm-1.1μm粒径的颗粒；
步骤3，采样完成后，收集顶层水溶凝胶膜，加入无菌生理盐水，37℃水域10分钟，以确保充分溶解。
进一步地，每次采样前均采用气流校准器校准采样器的流速。
优选在37℃水域保温10min，以确保充分溶解。
优选琼脂层体积为27ml，核孔膜直径为90mm，可溶凝胶膜直径为80mm。
上述得到的溶解样品用于进行核酸检测或病毒培养。
本发明基于六级撞击式采样器实现病毒气溶胶采样。传统采样方式使用琼脂培养皿作为采样介质，可将浮游菌直接采集到的琼脂培养基上，经过培养后鉴定可培养菌落浓度、菌群及粒径分布。本方法在传统方法上进行改进使用可溶凝胶膜进行采样，实现病毒气溶胶分级采样，采集完成后样品便于回收。本方法在样品采集后，可直接将可溶凝胶膜溶于少量液体中，实现大量气溶胶到少量水溶胶的转变，样品得到浓缩，可提高检测灵敏度，后续进行核酸提取或病毒培养。
具体实施方式
实施例1
病毒气溶胶分级采样方法，包括步骤如下：
步骤1：准备试剂
病毒rna提取试剂盒购自qiagen公司；primescripttmrtreagenkitwithgdnaeraser反转录试剂盒购自大连宝生物工程(大连)有限公司；powersybrgreenpcrmastermix购自美国abi公司；水溶凝胶膜购自德国赛多利斯公司；0.05μm核孔膜购自whatman公司；tsa培养基购自美国bd公司。
步骤2：准备仪器
六级撞击式采样器购自美国tisch公司；定量采样泵zr2000购自青岛众瑞智能仪器有限公司；普通pcr仪及荧光定量pcr仪购自美国abi公司；超净工作台购自海尔公司；
步骤3：准备采样平皿，制备琼脂层
取20gtsa固体培养基放入锥形瓶中，加入500mlddh2o混匀至锥形瓶底部无附着物，放入高压灭菌锅中灭菌(121℃、15min)，灭菌完成后取出锥形瓶，使用量筒量取27ml培养基，倒入9cm平皿中，等待自然冷却。
步骤4：采集样品
将固体培养基上放置一层0.05μm核孔膜，然后再放置水溶凝胶膜，随后依次装入6级撞击式采样器的各个层级中，使用胶体软管连接六级采样器和zr-2000采样泵，打开采样泵并设置采样速率(28.3l/min)及采样时间，点击开始按钮开始样品采集。
步骤5：回收样品
采样结束后，将各层级中的水溶凝胶膜取出，转移至50ml离心管中并做好标记，向每个离心管中加入5ml无菌生理盐水，涡旋震荡，37℃水域孵育10min，直至水溶凝胶膜完全溶解。
步骤6：病毒核酸检测
采用qiagen公司病毒rna提取试剂盒提取样品中病毒rna，并采用takara反转录试剂盒将rna反转录为cdna。随后采用特异性引物进行荧光定量pcr检测。通过设定标准品可实现病毒拷贝数的绝对定量。
步骤7：病毒毒力滴定
将易感细胞接种6孔细胞培养板，待细胞密度100％后，弃掉培养基，取1ml样品孵育细胞1小时，随后采用无菌pbs清洗细胞3次，加入低熔点琼脂糖培养基。待琼脂糖室温凝固后放入细胞培养箱倒置培养48-72h。最后，进行细胞染色，计数蚀斑数量，进而获得病毒毒力。
1.一种病毒气溶胶分级采样方法，其特征在于，包括步骤如下：
步骤1，改进六级撞击式采样器，每级采样器的收集板从原来的单一琼脂层变更为从下到上依次为琼脂层、孔径为0.05μm的核孔膜、可溶凝胶膜；将收集板依次装入六级撞击式采样器的各个层级中；
步骤2，当六级撞击式采样器以28.3l/min的流速运行时，气溶胶颗粒将根据粒径筛分为六级：第一级收集粒径大于7μm的颗粒，第二级收集粒径为4.7μm-7μm的颗粒，第三级收集粒径为3.3μm-4.7μm的颗粒，第四级收集粒径2.1μm-3.3μm的颗粒，第五级收集粒径1.1μm-2.1μm的颗粒，第六级收集粒径为0.65μm-1.1μm粒径的颗粒；
步骤3，采样完成后，收集顶层水溶凝胶膜，加入无菌生理盐水，37℃水域10分钟，以确保充分溶解。
2.根据权利要求1所述的病毒气溶胶分级采样方法，其特征在于，每层收集板的琼脂层体积为27ml，核孔膜直径90mm，可溶凝胶膜直径80mm。
3.根据权利要求1或2所述的病毒气溶胶分级采样方法，其特征在于，每次采样前均采用气流校准器校准采样器的流速。
4.采用权利要求1-4任一所述病毒气溶胶分级采样方法得到的溶解样品用于进行核酸检测或病毒培养。