一种非发酵型酿酒酵母工程菌及其构建方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种非发酵型酿酒酵母工程菌及其构建方法。


背景技术：

2.传统酿酒酵母在有氧条件下偏好利用葡萄糖发酵生产乙醇，该现象称之为克勒勃屈利。当酿酒酵母作为细胞工厂用于生物制造、蛋白质生产等方面应用时，大量碳源消耗用于乙醇副产物的积累，导致目标产品得率降低。目前通过敲除葡萄糖转运蛋白的方式(embo rep2004,5:532-537)，以及通过敲除乙醇合成路径并引入柠檬酸裂合酶补偿乙酰辅酶a(nat commun,2018,9:3059)等策略已成功地应用于不产乙醇酿酒酵母的构建。然而，通过合成生物学技术，动态调控葡萄糖利用速率实现非发酵型酿酒酵母的研究尚未报道。


技术实现要素：

3.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种非发酵型酿酒酵母工程菌及其构建方法。
4.为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种非发酵型酿酒酵母工程菌的构建方法，其包括：
5.将酿酒酵母菌株cenpk2-1c的hxk2、glk1己糖激酶基因敲除，将hxk1己糖激酶的启动子替换为adh2醇脱氢酶的启动子。
6.根据本发明实施例的非发酵型酿酒酵母工程菌的构建方法，该方法构建得到的酿酒酵母工程菌中hxk2、glk2己糖激酶被敲除，hxk1己糖激酶的启动子替换为adh2醇脱氢酶启动子。由于hxk1己糖激酶的表达受到adh2启动子的反馈抑制调控，从而获得一株代谢状态由发酵型转变为有氧呼吸型的酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌的代谢状态转变为非发酵型，且具有较好的生物质积累，因而具有广阔的工业化应用前景。
7.可选地，所述hxk2基因敲除片段是以核苷酸序列如seq id no:1所示的hxk2_fwd和核苷酸序列如seq id no:2所示的hxk2_rev为引物，经pcr扩增得到。
8.可选地，所述glk1基因敲除片段是以核苷酸序列如seq id no:3所示的glk1_fwd和核苷酸序列如seq id no:4所示的glk2_rev为引物，经pcr扩增得到。
9.可选地，将hxk2以及glk1通过基因组编辑手段敲除。
10.可选地，所述adh2醇脱氢酶的启动子是以酿酒酵母基因组为模版，以核苷酸序列如seq id no:5所示的adh2_fwd和核苷酸序列如seq id no:6所示的adh2_rev为引物，经pcr扩增得到。
11.可选地，将hxk1己糖激酶的启动子通过基因组编辑手段替换为adh2醇脱氢酶的启动子。
12.在本发明的第二个方面，本发明提出一种非发酵型酿酒酵母工程菌，其通过上述的构建方法构建得到。该酿酒酵母菌的代谢状态由发酵型转变为有氧呼吸型，具有较好的
no:7所示的adh2_fwd和核苷酸序列如seq id no:8所示的adh2_rev为引物，经高保真酶pcr扩增得到约500bp的adh2启动子条带，将目的条带经过dna纯化试剂盒回收，得到胶回收产物。其中，pcr扩增体系为：10x缓冲液5μl，phusion聚合酶0.2μl，10mm dntp mixture 1μl,10μm引物分别1μl，酵母基因组1μl，ddh2o 41μl。pcr扩增条件：98℃2min，98℃10s，56℃30s，72℃1min，循环30次；72℃2min。
25.表1：pcr扩增所用引物
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下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
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实施例1
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非发酵型酿酒酵母工程菌的构建：
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将hxk2敲除片段、glk1敲除片段与adh2启动子通过crispr/cas9介导的基因组编辑技术(参考文献nucleic acids res.2013,41,4336-4343敲除)，敲除酿酒酵母cen.pk2-1c菌株的hxk2、glk1以及替换hxk1启动子，获得非发酵型的酿酒酵母工程菌株sc-cran。
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实施例2
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将实施例1的酿酒酵母工程菌sc-cran按1:100比例接入50ml ypd培养液中，在30℃，200rpm培养72h，通过酶标仪测od600记录酵母生长趋势。其中对照组(酿酒酵母菌cen.pk2-1c)采用相同的实验操作。
[0033]
结果如图1所示，酿酒酵母的生长趋势图说明了非发酵型酵母具有较好的生物质积累能力。
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实施例3
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将实施例1的酿酒酵母工程菌sc-cran按1:100比例接入50mlypd培养液中，在30℃，200rpm培养24h，通过气相色谱检测乙醇以及其他醇的含量。其中对照组(酿酒酵母菌cen.pk2-1c)采用相同的实验操作。
[0036]
结果如图2所示，酿酒酵母气相色谱分析乙醇产量图。相较于酿酒酵母菌cen.pk2-1c，酿酒酵母工程菌sc-cran可减少乙醇以及其他醇的产生量，使用该酵母底盘用于生物合成，可以保证碳源尽可能多的转移到目标产品。
[0037]
综上，根据本发明构建的酿酒酵母工程菌，可动态调控葡萄糖利用速率实现非发酵型酿酒酵母，具有广阔的工业化应用前景。
[0038]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0039]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。


技术特征：
1.一种非发酵型酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：将酿酒酵母菌株cenpk2-1c的hxk2、glk1己糖激酶基因敲除，将hxk1己糖激酶的启动子替换为adh2醇脱氢酶的启动子。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述hxk2基因敲除片段是以核苷酸序列如seq id no:1所示的hxk2_fwd和核苷酸序列如seq id no:2所示的hxk2_rev为引物，经pcr扩增得到。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述glk1基因敲除片段是以核苷酸序列如seq id no:3所示的glk1_fwd和核苷酸序列如seq id no:4所示的glk2_rev为引物，经pcr扩增得到。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将hxk2以及glk1通过基因组编辑手段敲除。5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述adh2醇脱氢酶的启动子是以酿酒酵母基因组为模版，以核苷酸序列如seq id no:5所示的adh2_fwd和核苷酸序列如seq id no:6所示的adh2_rev为引物，经pcr扩增得到。6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将hxk1己糖激酶的启动子通过基因组编辑手段替换为adh2醇脱氢酶的启动子。7.一种非发酵型酿酒酵母工程菌，其特征在于，由如权利要求1-6中任一项所述的构建方法构建得到。

技术总结
本发明涉及一种非发酵型酿酒酵母工程菌及其构建方法，其构建方法包括：将酿酒酵母菌株CENPK2-1C的HXK2、GLK1己糖激酶基因敲除，将HXK1己糖激酶的启动子替换为ADH2醇脱氢酶的启动子。从而获得一株代谢状态由发酵型转变为有氧呼吸型的酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌的代谢状态转变为非发酵型而不产乙醇，可作为底盘细胞更为高效地生产高附加值化学品，且具有较好的生物质积累，因而具有广阔的工业化应用前景。前景。


技术研发人员：袁吉锋
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2021.04.16
技术公布日：2022/10/20