一种靶向根肿菌PbTPS1基因防治根肿病的活性siRNA及其应用

本发明属于生物技术和植物病害防治领域，具体涉及一种靶向根肿菌pbtps1基因的活性sirna及其应用。
背景技术：
：：由芸薹根肿菌侵染引起的根肿病是威胁全球十字花科作物生产的主要病害之一，该病菌侵染作物根部形成肿根，影响作物根系养分和水分吸收，导致植株地上部萎蔫，甚至死亡(dixon,2009；wang等，2020)。在我国，根肿菌每年侵染约3.2-4.0百万公顷十字花科作物，约占十字花科作物种植面积的1/3，平均年产量损失约20-30％(chai等，2014)。作为一种土传专性寄生菌，根肿菌几乎在作物根细胞中完成整个生活史，且在土壤中具有很强的存活能力，导致该病害的防治极为困难(rolfe等，2016)。目前，根肿病的防治仍以选育抗病品种和化学防治为主(peng等，2014；song等，2016；niemann等，2017)。在我国，目前登记在根肿病防治上的主要农药成分有3种：氟啶胺、氰霜唑和枯草芽孢杆菌。但杀菌剂的使用会直接或间接改变土壤结构，影响土壤微生物群落，使得农田土壤生态系统失衡(kong等，2018)。枯草芽孢杆菌更多的是起到预防根肿病的作用，且受环境因素影响较大，防效不稳定。因此，积极探索不同的根肿病防治措施对根肿病的防治非常重要。基于sirna的rnai是防治植物病虫害的新途径，是实现不同生物/组织基因沉默的有效工具。其中应用较多的是转录后基因沉默，即表达dsrna或sirna，靶向降解mrna(govindarajulu等，2014)。而直接施用sirna防治植物病害也有报道，wang等(2016)的研究结果表明，在水果、花卉和蔬菜表面施用特定sirna能显著抑制灰霉病的发生。尽管目前文献未报道根肿菌rnai现象的存在，但根肿菌基因组中仍存在实现rnai的部分基因(schwelm等，2015)。而以根肿菌萌发侵染的关键基因作为靶标则可能挖掘到潜在的防治靶标，如根肿菌休眠孢子萌发过程中几丁质酶基因(帮助降解细胞壁)，糖代谢和脂肪代谢相关途径的基因等。除此之外，根肿菌在侵染植物过程中会调控植物激素途径和碳循环途径以利于其侵染繁殖。例如目前已报道肿根形成过程中，会刺激生长素和细胞分裂素的合成，以及积累淀粉、二糖海藻糖和海藻糖等(brodmann等，2002)。因此，根肿菌侵染过程中可能合成海藻糖激活植物的海藻糖感应系统，改变植物细胞碳代谢以利于其侵染。以根肿菌海藻糖合成酶基因为靶标则可能阻碍根肿菌的侵染过程，防治根肿病。参考文献如下：1.dixon,g.r.(2009).theoccurrenceandeconomicimpactofplasmodiophorabrassicaeandclubrootdisease.j.plantgrowthregul.28,194-202.2.wang,d.,sun,t.,zhao,s.,pan,l.,liuh.,andtian,x.(2020).physiologicalchangealtersendophyticbacterialcommunityinclubrootoftumorousstemmustardinfectedbyplasmodiophorabrassicae.bmcmicrobiol.20,244.3.chai,a.l.,xie,x.w.,shiy.x.,andli,b.j.(2014).researchstatusofclubroot(plasmodiophorabrassicae)oncruciferouscropsinchina.can.j.plantpathol.36(s1),142-153.4.rolfe,r.a.,strelkov,s.e.,links,m.g.,clarke,w.e.,robinson,s.j.,djavaheri,m.,malinowski,r.,haddadi,p.,kagale,s.,parkin,i.a.p.,taheri,a.,andborhan.m.h.,(2016).thecompactgenomeoftheplantpathogenplasmodiophorabrassicaeisadaptedtointracellularinteractionswithhostbrassicaspp.bmcgenomics.17,272.5.peng,g.,lahlali,r.,hwang,s.f.,pageau,d.,hynes,r.k.,mcdonald,m.r.,gossen,b.d.,andstrelkov,s.e.(2014).croprotation,cultivarresistance,andfungicides/biofungicidesformanagingclubroot(plasmodiophorabrassicae)oncanola.can.j.plantpathol.36(s1),99-112.6.song,t.,chu,m.,lahlali,r.,yu,f.,andpeng,g.(2016).shotgunlabel-freeproteomicanalysisofclubroot(plasmodiophorabrassicae)resistanceconferredbythegenercr1inbrassicarapa.front.plantsci.7,1013.7.niemann,j.,kaczmarek,j.,ksiazczyk,t.,wojciechowski,a.,jedryczka,m.(2017).chinesecabbage(brassicarapaspp.pekinensis)-avaluablesourceofresistancetoclubroot(plasmodiophorabrassicae).eur.j.plantpathol.147,181-198.8.kong,x.,jin,d.,jin,s.,wang,z.,yin,h.,xu,m.,deng,y.(2018).responsesofbacterialcommunitytodibutylphthalatepollutioninasoil-vegetableecosystem.j.hazard.mater.353,142-150.9.schwelm,a.,fogelqvist,j.,knaust,a.,jülke,s.,lilja,t.,bonilla-rosso,g.,karlsson,m.,shevchenko,a.,dhandapani,v.,choi,s.r.,kim,h.g.,park,j.y.,lim,y.p.,ludwig-müller,j.,anddixelius,c.(2015).theplasmodiophorabrassicaegenomerevealsinsightsinitslifecycleandancestryofchitinsynthases.sci.rep.-uk.5:11153.10.govindarajulu,m.,epstein,l.,wroblewski,t.,andmichelmore,r.w.(2014).host-inducedgenesilencinginhibitsthebiotrophicpathogencausingdownymildewoflettuce.plantbiotechnol.j.13(7):875.11.brodmann,d.,schuller,a.,ludwig-müller,j.,aeschbacher,ra.,wiemken,a.,boller,t.,andwingler,a.(2002).inductionoftrehalaseinarabidopsisplantsinfectedwiththetrehalose-producingpathogenplasmodiophorabrassicae.mpmi.15(7):693-700.12.wang,m.,weiberg,a.,lin,f.m.,thomma,b.,huang,h.d.,andjin,h.l.(2016).bidirectionalcross-kingdomrnaiandfungaluptakeofexternalrnasconferplantprotection.nat.plants.2:16151.技术实现要素：pbtps1是根肿菌中6-磷酸海藻糖合成酶基因(af334707)，在根肿菌侵染拟南芥的过程中，该基因的表达模式与拟南芥中海藻糖的积累模式一致。植物为防止海藻糖的过量积累，会产生海藻糖酶对海藻糖进行酶解，也是植物的防御反应之一。因此，以该基因作为靶标，抑制根肿菌侵染过程中海藻糖的合成，达到防治根肿病的目的。因此，本发明提供一种靶向根肿菌pbtps1基因的sirna，所述的sirna的正义链或反义链序列如下所示：正义链：5’-ucauuuccauguucuugactt-3’(seqidno.1)，反义链：5’-gucaagaacauggaaaugatt-3’(seqidno.2)。同时，本发明提供所述的靶向根肿菌pbtps1基因的sirna在防治根肿病中的应用。本发明还提供一种防治十字花科作物根肿病的药物，所述药物的活性成分为靶向根肿菌pbtps1基因抑制植物肿根形成的sirna。所述的药物，优选地，所述的sirna的正义链或反义链序列如下所示：正义链：5’-ucauuuccauguucuugactt-3’，反义链：5’-gucaagaacauggaaaugatt-3’。所述的药物，优选地，所述十字花科作物为芸薹属，更具体为茎瘤芥(榨菜)。本发明还提供一种十字花科作物根肿病的防治方法，该方法在植株的茎基部注射所述的sirna的溶液。通过持续在植株茎基部向根系注射20nmsirna溶液能显著抑制肿根形成，提高sirna浓度不能提高其作用效果，但降低浓度会降低作用效果。所述的防治方法，优选地，所述sirna的溶液的浓度为20nm。本发明首次报道针对根肿菌中的pbtps1基因合成sirna(pbtps1-1)能抑制榨菜根肿病的发生，主要表现在抑制肿根的形成。以任何形式包装改造的sirna，包括添加sirna活性促进剂、稳定剂或纳米材料等均属于本发明的保护范围。本发明具有以下有益效果：该sirna处理能显著缓解茎瘤芥根肿病症状，根肿菌中靶标基因pbtps1的表达、肿根中海藻糖含量、产孢量、肿根鲜重和海藻糖酶活等显著降低，表明该sirna处理对茎瘤芥根肿病具有一定的防效。附图说明图1sirna处理后茎瘤芥根肿病发病情况(第二次温室试验)。其中，(a)肿根表型，图中标尺表示1cm；(b)肿根鲜重，不同字母代表差异显著(p<0.05)；(c)病情指数。图2sirna处理后茎瘤芥根肿病发病情况(第三次温室试验)。其中，(a)肿根表型，标尺为1cm，(b)肿根鲜重，(c)病级分布和病情指数，di表示病情指数。nc-sirna：对照组，pbtps1-1sirna：处理组。图3pbtps1-1sirna靶标序列与茎瘤芥海藻糖合成酶基因bjub030262的序列比对。图4sirna处理对根肿菌侵染力及休眠孢子形成的影响。其中，(a)pbtps1基因的表达水平，(b)根肿菌产孢能力，(c)海藻糖酶活。nc-sirna：对照组，pbtps1-1sirna：处理组。图5sirna处理后茎瘤芥肿根中糖含量。其中，(a)海藻糖、(b)蔗糖、(c)葡萄糖、(d)d-果糖、(e)d-阿拉伯糖、(f)d-半乳糖、(g)l-鼠李糖、(h)麦芽糖、(i)肌醇。数据为3次重复，2次技术重复平均值和标准误。t-检验为双尾方差齐性检验，*表示差异显著水平p<0.05。图6根肿菌休眠孢子吸收外源sirna的荧光检测。其中，(a)nc-sirna明场图，(b)nc-sirna经蓝光激发后的荧光图，(c)带fam荧光标签的nc-sirna明场图，(d)带fam荧光标签的nc-sirna经蓝光激发后的荧光图。图中标尺为20μm。图7sirna处理对茎瘤芥根肿菌休眠孢子萌发的影响。具体实施方式下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。海藻糖作为一种非还原性双糖，具有为生物体提供能量，调节碳氮代谢，组成细胞壁和抵抗环境胁迫等功能，tps1基因则是海藻糖合成途径中的主要基因之一。研究表明，稻瘟病菌tps1突变体不仅产孢能力降低，且形成的附着孢膨压较低，不能发育产生完整的侵染菌丝，最终导致稻瘟病菌致病力减弱(foster等，2003)。因此，本发明人以该基因为靶标进行研究，探索其在根肿菌的致病力方面的影响。本发明针对根肿菌中的pbtps1合成3对sirna序列(表1、seqidno.1-no.8)，通过温室试验筛选对茎瘤芥根肿病发病有影响的sirna。表13对靶向pbtps1的sirna序列试验方法：将草炭土和蛭石以3:1体积比混匀后121℃灭菌，分装于育苗盆中(9cm长×9cm宽×11cm高)待用。涪杂2号种子经50％漂白液表面灭菌并无菌水清洗后，放置培养皿中催芽至露白，再播种于以上处理好的育苗盆中，第一次温室实验设置2个浓度梯度：10nm和20nm，第二次实验设置20nm和40nm，第三次试验设置20nm。根肿菌休眠孢子悬浮液的制备：称取150g肿根，自来水冲洗干净后切成小块，放入组织破碎仪中，加入150ml无菌水匀浆，匀浆过8层纱布后100g离心5min，上清液即为根肿菌休眠孢子悬浮液。用血球计数板计算根肿菌休眠孢子的浓度，并用无菌水稀释至终浓度为1×107个/ml。无酶水的制备：取0.5mlrna酶抑制剂加入500ml超纯水中剧烈振荡后室温放置数小时，再121℃高压蒸汽灭菌20min。sirna溶液的制备：合成的sirna干粉每管2.5nmol，每管加入100μl无酶水配成25μm母液，配制10、20和40nm浓度sirna溶液时，分别取8、16和32μl母液，加无酶水至总体积为20ml。待榨菜苗生长3周后接种1×107个/ml根肿菌休眠孢子悬浮液，每株植株在茎基部注射1ml。在接种后1d、4d、7d、12d、16d和21d以同样的方式注射sirna溶液，每株注射1ml。接种后3周或5周调查根肿病发病情况并称量肿根鲜重。根肿病发病程度按0-4级进行，即0级＝未发病，无肿根；1级＝肿根很小，且主要再侧根上，主根上无肿根；2级＝肿根较小，主要在主根上，少量在侧根上；3级＝中等大小的肿根，主根和侧根上均有，可能影响植株的生长；4级＝侧根和主根上严重的肿根。研究结果：1、靶向根肿菌pbtps1-1sirna能显著缓解茎瘤芥根肿病症状第一次温室试验初筛发现仅pbtps1-1对榨菜根肿病的发生有影响(表2)，从表中数据可以看出pbtps1-1处理20nm5w样品肿根重和病情指数最低，单因素anova检测处理间均差异不显著，但t检验表明该处理与对照肿根重差异显著。为进一步验证该实验结果，进一步合成pbtps1-1和pbtps1-3进行第二次温室试验，且扩大取样样本量。发现pbtps1-1能显著抑制肿根的形成，主要表现在肿根鲜重显著低于对照(ck，肿根鲜重平均值在20nm和40nm处理时分别为2.54g和2.37g)，pbtps1-1处理后，肿根鲜重平均值为1.53(20nm)和1.61g(40nm)，且病情指数最低为54.17％(20nm)和52.78％(40nm)(图1)。由此表明，根肿菌pbtps1可为防治根肿病的靶标之一，而pbtps1-1sirna具有根肿病防治活性，在本试验处理中，pbtps1-1sirna最适处理浓度为20nm，高于此浓度其活性并未增强，低于此浓度活性减弱。不同浓度pbtps1-3处理后，茎瘤芥肿根重与对照差异不显著，肿根鲜重平均值为2.06(20nm)和2.13g(40nm)，且病情指数也与对照差异较小，20nm和40nm处理病情指数分别为59.72％和58.33％。表2sirna处理后茎瘤芥肿根鲜重及病情指数注：表中相同的字母表示同一取样时间，不同处理之间的差异显著性(单因素anova分析，p<0.05)。*表示同一取样时间下处理和对照的差异显著性(t-检验，p<0.05)。进一步扩大样本量(每处理约90株茎瘤芥)，以20nmnc-sirna和pbtps1-1sirna处理接种后茎瘤芥，接种后5周调查根肿病发病程度(病级分布和病情指数)，观察肿根表型，测定肿根重。研究结果表明(图2)：pbtps1-1处理的肿根明显比对照组小，处理组肿根鲜重平均值为2.90g，显著低于对照组3.35g，t检测p＝0.036；处理组根干重平均值为0.34g，低于对照组0.39g，差异不显著。pbtps1-1处理后，根肿病病级分布为1级、2级和3级，分别占比12.50％、39.77％和47.73％，对照组未检出1级，2和3级分别占比40.00％和60.00％，且均高于处理组。pbtps1-1处理组的病情指数为58.8％，低于对照组的65.0％。该研究结果表明，pbtps1-1sirna处理影响了根肿菌的致病性，缓解了根肿病发病程度。将pbtps1-1sirna靶标序列与茎瘤芥中可能的海藻糖合成酶基因进行序列比对分析(图3)，发现该序列与茎瘤芥中bjub030262cds序列相似性最高，共12个碱基序列能完全互补配对，但配对碱基较分散，初步认为该sirna对茎瘤芥中海藻糖合成酶基因无作用或作用极小。2、pbtps1-1sirna处理后，pbtps1基因表达、产孢量和海藻糖酶活性均显著降低为揭示pbtps1-1sirna缓解根肿病发病程度的机制，检测了根肿菌中pbtps1基因的表达、休眠孢子产孢量及海藻糖酶活。研究结果表明(图4)：pbtps1-1处理6次后，接种后5周肿根中pbtps1基因表达显著低于对照，t检验p＝0.011。pbtps1-1处理单株植株肿根产孢量平均值为9.60×108个/ml，显著低于对照组平均值1.12×109个/ml，t检验p＝0.009，但每克组织中休眠孢子量差异不显著。有文献报道，根肿菌侵染后，拟南芥中海藻糖酶活上调进行防御，抑制根中海藻糖的积累。因此，海藻糖酶活的高低可能预示植物防御反应的强弱，反之则表明根肿菌侵染能力的高低。本发明人构建了海藻糖酶活与吸光度值的标准曲线y＝1.024x+0.2105，r2＝0.992，测定不同处理样本在540nm的吸光度值，通过该公式计算出不同处理每克样本海藻糖酶活。研究结果表明(图4c)，pbtps1-1sirna处理后，肿根中海藻糖酶活为247.62u/g，显著低于对照组268.10u/g，t检验p＝0.022。因此，pbtps1-1sirna处理显著降低了根肿菌pbtps1基因的表达，影响了休眠孢子的形成，使得根肿菌侵染力降低。3、pbtps1-1sirna处理后肿根中海藻糖等糖含量显著降低由于pbtps1是海藻糖合成途径中的关键酶，因此，在pbtps1-1sirna处理显著降低pbtps1基因表达水平后，是否影响根肿菌中海藻糖的合成？通过gc-ms分析不同处理肿根中海藻糖及其他糖含量的变化，研究结果表明(图5)，pbtps1-1sirna处理后，肿根中海藻糖含量平均值为6.27mg/g，显著低于对照7.65mg/g。其他糖含量，包括蔗糖、葡萄糖、d-果糖、d-阿拉伯糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、麦芽糖和肌醇在处理和对照中差异不显著。由此表明，pbtps1基因下调后，海藻糖含量也相应降低。表明pbtps1-1sirna处理下调靶标基因表达，使得海藻糖合成受阻，从而影响了休眠孢子的形成，缓解了茎瘤芥根肿病症状。4、根肿菌休眠孢子能够吸收外源sirna但不影响休眠孢子萌发通过以上研究，明确pbtps1-1sirna使得根肿菌的致病性降低，其是否会作用于休眠孢子萌发阶段还需要进一步研究。首先，利用带fam荧光标签的nc-sirna处理根肿菌休眠孢子72h，检测根肿菌休眠孢子是否能吸收外源sirna。研究结果表明(图6)，经蓝光激发后，部分根肿菌休眠孢子释放出明显的绿色荧光，表明休眠孢子能够吸收外源sirna。而未带荧光标签的nc-sirna处理72h的休眠孢子在蓝光激发后没有明显的绿色荧光。利用20nmsirna处理根肿菌休眠孢子，分别于处理后24h、48h、72h、96h检测休眠孢子萌发情况。研究结果表明(图7)，处理后24h，根肿菌休眠孢子萌发率在pbtps1-1和nc-sirna中的平均值分别为47.73％和45.03％，随着处理时间的延长，休眠孢子萌发率逐渐升高，至96h时，处理和对照中休眠孢子萌发率分别为70.63％和63.93％，72和96h时休眠孢子萌发率差异不显著，但显著高于24和48h。pbtps1-1和对照组在每一调查时间点的休眠孢子萌发率差异不显著。这一结果表明，pbtps1-1sirna处理并不影响孢子的萌发。<110>长江师范学院<120>一种靶向根肿菌pbtps1基因防治根肿病的活性sirna及其应用<160>8<210>1<211>21<212>rna<400>1ucauuuccauguucuugactt21<210>2<211>21<212>rna<400>2gucaagaacauggaaaugatt21<210>3<211>21<212>rna<400>3ucaaguucgaguucuucagtt21<210>4<211>21<212>rna<400>4cugaagaacucgaacuugatt21<210>5<211>21<212>rna<400>5uuucuugaacucgucaaugtt21<210>6<211>21<212>rna<400>6cauugacgaguucaagaaatt21<210>7<211>21<212>rna<400>7uucuccgaacgugucacgutt21<210>8<211>21<212>rna<400>8acgugacacguucggagaatt21当前第1页12当前第1页12