一种基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法

本发明属于水稻抗虫表型鉴定
技术领域：
。更具体地，涉及一种基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法。
背景技术：
：褐飞虱是危害水稻的主要害虫之一，其暴发可导致稻田大量减产，严重威胁粮食安全。抗虫水稻品种的选育和推广被认为是控制褐飞虱为害、确保粮食安全的重要手段之一，且具有经济、环保、可持续等优点。目前水稻抗虫表型的鉴定过程中，对于害虫自身的遗传背景往往不作要求。例如中国专利cn112083128a公开了一种水稻高产抗虫害性表型鉴定方法，其通过采集害虫感染处理水稻后的高光谱图像并分析，根据公式计算获得水稻高产抗虫害性，对害虫未做任何要求。中国专利cn111264320a公开了一种水稻成株期褐飞虱抗性精准鉴定的方法，鉴定过程中需要人工接虫，但对所接害虫没有特殊要求。这些方法中选用的褐飞虱种群多数为实验室长期饲养的种群，往往与田间种群实际的遗传背景有较大差异。如此选育出来的品种在田间施用后，很快就被田间种群适应，甚至是对田间种群根本不具备应有的抗性表型，无法真实反映选育的品种对于田间褐飞虱种群的真实抗性水平，导致最终使用效果不如预期。而如果简单地使用田间种群来进行水稻抗虫性的试验，在不清楚田间种群的致害性相关遗传背景情况下，往往很难得到可靠和理想的结果。因此，为了更加准确进行水稻品种抗虫性评价，就需要先清楚田间褐飞虱种群致害性相关遗传背景。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法。本发明的第一个目的是提供褐飞虱细胞色素p450cyp4c61基因的多态性位点88-254-352-542和烟碱乙酰胆碱受体α-7样基因的多态性位点576-580组合在制备褐飞虱致害性基因型鉴定试剂盒、鉴定褐飞虱致害性水平和评估抗虫水稻品种潜在适用性中的应用。本发明的第二个目的是提供一种鉴定褐飞虱致害性基因型的试剂盒。本发明的第三个目的是提供一种鉴定褐飞虱致害性基因型的方法。本发明的第四个目的是提供一种基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法。本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明首先提供了seqidno.5所示褐飞虱细胞色素p450cyp4c61基因的多态性位点88-254-352-542和seqidno.6所示烟碱乙酰胆碱受体α-7样(nachr-α-7-like)基因的多态性位点576-580组合与褐飞虱致害性基因型的关系，如表所示：其中genotype1为非致害性基因型，genotype2和genotype3为致害性基因型。通过检测褐飞虱细胞色素p450cyp4c61基因的多态性位点261588-261754-261852-262042(即seqidno.5序列第88位、第254位、第352位以及第542位碱基)和烟碱乙酰胆碱受体α-7样(nachr-α-7-like)基因的多态性位点251576-251580(即seqidno.6序列第576位和第580位碱基)的基因型，即可根据表格判断所测褐飞虱是否为致害性基因型。因此，本发明申请保护褐飞虱烟碱乙酰胆碱受体α-7样基因的多态性位点251576-251580和细胞色素p450cyp4c61基因的多态性位点261588-261754-261852-262042的基因型在鉴定褐飞虱致害性基因型、制备褐飞虱致害性基因型鉴定试剂盒和/或评估抗虫水稻品种潜在适用性中的应用。本发明提供了一种褐飞虱致害性基因型的鉴定试剂盒，其包含检测褐飞虱细胞色素p450cyp4c61基因的多态性位点261588-261754-261852-262042(即seqidno.5序列第88位、第254位、第352位以及第542位碱基)和烟碱乙酰胆碱受体α-7样基因的多态性位点251576-251580的基因型的试剂。本发明还提供了一种鉴定褐飞虱致害性基因型的方法，其包含以下步骤：s1.提取褐飞虱基因组dna；s2.以步骤s1所得dna为模板，分别对褐飞虱烟碱乙酰胆碱受体α-7样基因和细胞色素p450cyp4c61基因片段进行pcr扩增；s3.扩增产物测序后，与上述表格进行比对。优选地，步骤s2所用pcr扩增引物序列如seqidno.1～4所示，见实施例1。优选地，步骤s2所用pcr扩增反应体系为20ng/μl模板dna1μl，10μm正向引物2μl，10μm反向引物2μl，2×hifimix25μl，ddh2o20μl，总计50μl，见实施例1。优选地，步骤s2所述pcr扩增程序为95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s的条件下进行30个循环；最后72℃再延伸5min，见实施例1。本发明进一步通过引入具有不同致害性相关基因型的褐飞虱种群来进行水稻抗虫表型鉴定试验，从而得到更真实可靠的表型数据，可以有效评价水稻抗虫性表型的有效性水平。本发明还提供一种基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法，其包含以下步骤：s1.以田间捕获的褐飞虱田间种群为f0代，将其置于感虫水稻品种上扩繁一代得f1；s2.待f1长至成虫后，将雌成虫与雄成虫两两配对，转到处于分蘖中期的感虫水稻上单独饲养，确保雌虫与雄虫交配并产卵7天后，取走亲代成虫并分别单头提取基因组dna；s3.以步骤s2所得dna为模板，分别对褐飞虱细胞色素p450cyp4c61基因和烟碱乙酰胆碱受体α-7样基因进行pcr扩增；s4.对所得pcr产物进行测序，获得褐飞虱个体cyp4c61基因和nachr-α-7-like基因上相应snp的基因型；s5.将所得基因型与上述表格进行比对，分别获得非致害性基因型genotype1、致害性基因型genotype2和genotype3的子代，若配对的亲本基因型为同种基因型且每个位点均不为杂合基因型，则其后代可保留下来作为特定的纯合基因型子代；s6.分别使用三种基因型的纯合子代对目标水稻品种进行抗虫性试验，若目标水稻品种对三种基因型的褐飞虱均具有抗性，且抗性水平在不同基因型纯合子代之间无显著差异，则认为目标品种具有较稳定的优良抗虫性；若目标水稻品种对三种基因型的褐飞虱均具有抗性，但对致害性基因型genotype2和genotype3的褐飞虱抗性水平显著低于对非致害性基因型genotype1褐飞虱的抗性水平，则认为目标品种目前虽具有抗虫性，但存在抗虫性失效的风险；若目标水稻品种对非致害性基因型genotype1的褐飞虱具有抗性，但对致害性基因型genotype2和genotype3的褐飞虱的其中一种或两种不具有抗性，则认为目标品种不具有可在田间应用的抗虫性。优选地，所述感虫水稻品种为tn1，见实施例2。本发明还申请保护所述试剂盒、所述方法在褐飞虱评估抗虫水稻品种潜在适用性中的应用。本发明具有以下有益效果：本发明公开了褐飞虱烟碱乙酰胆碱受体α-7样基因的多态性位点251576-251580和细胞色素p450cyp4c61基因的多态性位点261588-261754-261852-262042的基因型与褐飞虱致害性基因型的关系。在此基础上，通过从田间捕获的褐飞虱中筛选获得非致害性基因型genotype1、致害性基因型genotype2和3的纯合子代，对目标水稻品种进行抗虫性试验，以此评估抗虫水稻品种潜在适用性。该方法较常规评估方法来说，克服了常规评价水稻抗虫品种表型测定时未考虑褐飞虱田间种群实际遗传背景所带来的缺陷，结果更为准确和可靠。本发明发现的遗传变异位点组合可将任意褐飞虱田间种群区分为3种致害性相关的基因型，具有极广的代表性和适用性。用这三种基因型的褐飞虱种群纯合后代来测试目标水稻品种的抗虫性，能够更客观地反映潜在的水稻抗虫品种今后在田间施用时的有效性。附图说明图1为本发明基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法技术路线图。图2为蜜露法测定的不同水稻品种对褐飞虱的抗性水平。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1不同地区褐飞虱田间种群致害性基因型分析为验证本发明所发现的遗传变异位点组合可将任意褐飞虱田间种群区分为3种致害性相关的基因型，具有极广的代表性和适用性。发明人于2017年在广东韶关、贵州遵义以及浙江舟山，对褐飞虱田间种群进行随机采样，并通过提取褐飞虱dna、pcr扩增及测序等步骤，将所采褐飞虱样本的致害性基因型进行了分类。1、褐飞虱基因组dna提取本发明使用omega公司的genomicdnaisolationkit试剂盒提取基因组dna，步骤如下：(1)取虫子在液氮中研磨充分，加500μl的buffergtc/2-me；(2)剧烈涡旋15s，室温静置2-3min，最长可以延长到5min；(3)13000转离心5min；(4)转移上清液至dnacolumn中，13000转离心1min；(5)将步骤4中的dnacolumn套在2ml收集管中，加500μlbufferhb到柱子中，13000转离心1min，弃滤液；(6)加700μl的dnawashbuffer到柱子中，13000转离心1min，弃滤液；(7)将柱子套回收集管，12000转离心2min，干燥柱子；(8)将柱子转移到新的1.5ml离心管，加50-100μlelutionbuffer，室温放置2min，13000转离心1min。2、褐飞虱nachr-α-7-like基因和cyp4c61基因的pcr扩增以上述的褐飞虱基因组dna为模板，用以下引物进行pcr扩增含有相应snp的片段。所述引物分别以褐飞虱的烟碱乙酰胆碱受体α-7样(nachr-α-7-like)基因(kn152279.1)和细胞色素p450cyp4c61基因(kn152684.1)为靶基因进行设计。其中nachr-α-7-like基因的扩增引物序列为：n-f：cattattcatacagatttgatggagag(seqidno.1)；n-r：cactaggtgtcaaatctacaaacc(seqidno.2)。cyp4c61基因的扩增引物序列为：p-f：tcgaaggtgagttgtttgttttgt(seqidno.3)p-r：agccctaaagagaaaagagacaatgt(seqidno.4)使用kapa公司的hifihotstartreadymixpcrkit试剂进行pcr扩增，在0.2ml的pcr离心管中加入下表所示试剂：pcr反应程序：加热盖，95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s的条件下进行30个循环；最后72℃再延伸5min。3、褐飞虱个体基因型分型将以上pcr产物送至测序公司直接测序，根据测序峰图分析序列。分析目标snp位点的组合，包括cyp4c61基因的261588、261754、261852以及262042四个位点(分别对应seqidno.5序列中的第88位、第254位、第352位以及第542位碱基)。以及nachr-α-7-like基因的251576和251580两个位点(分别对应seqidno.6序列中的第576位和第580位碱基)。褐飞虱细胞色素p450cyp4c61基因的多态性位点88-254-352-542和nachr-α-7-like基因的多态性位点576-580组合与褐飞虱致害性基因型的关系如表1所示，若目标snp位点的组合符合表1中genotype1的组合特征，则褐飞虱个体基因型为非致害性基因型genotype1；若所述目标snp位点的组合符合表1中genotype2的组合特征，则褐飞虱个体基因型为致害性基因型genotype2；若所述目标snp位点的组合符合表1中genotype3的组合特征，则褐飞虱个体基因型为致害性基因型genotype3。表1多态性位点与褐飞虱致害性基因型的关系不同地区褐飞虱田间种群致害性基因型分析结果如表2所示，共计263个样本，均可用本发明所发现的遗传变异位点组合将其区分为3种致害性相关的基因型之一，表明本发明所发现的遗传变异位点组合可将任意褐飞虱田间种群区分为3种致害性相关的基因型，具有极广的代表性和适用性。表2不同地区褐飞虱田间种群致害性基因型分析genotype1genotype2genotype3总数广东韶关19462186贵州遵义2754990浙江舟山2652987实施例2基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法一种基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法，技术路线图如图1所示。1、褐飞虱田间种群处理；于广东韶关的田间分别捕捉获得褐飞虱田间种群p-sg，并分别置于感虫水稻品种tn1上扩繁一代。待虫子长为成虫后，将雌成虫与雄成虫两两配对，转到处于分蘖中期的tn1水稻上单独饲养，确保雌虫与雄虫交配并产卵7天后，取走亲代成虫用于随后的基因组dna提取。2、单头褐飞虱基因组dna提取；3、褐飞虱nachr-α-7-like基因和cyp4c61基因的pcr扩增；4、褐飞虱个体基因型分型；2～4具体实验步骤参照实施例1进行。5、褐飞虱纯合基因型子代的获得若配对的亲本基因型为同种基因型且每个位点均不为杂合基因型，则其后代虫子可保留下来作为特定的纯合基因型子代，根据此依据分别获得该褐飞虱田间种群的genotype1、genotype2以及genotype3基因型的纯合子代。6、不同水稻品种对三种基因型纯合子代的抗性水平测定以感虫品种tn1水稻为对照，通过蜜露法测定水稻品种ir36和rathuheenati(r.h.)对褐飞虱不同基因型纯合子代的抗性水平。蜜露法检测的具体操作步骤为：将播种后30天的水稻品种稻苗单株移入塑料杯中(15cm×10cm)，去掉分蘖后留下主茎，将已饥饿3小时的褐飞虱成虫一天短翅型雌虫用吸管接入蜡膜小袋内，每个蜡膜小袋内接1头雌虫，然后将蜡膜小袋包裹在各处理稻株上，每处理5个重复。接虫之前蜡膜小袋先用电子天平称重。24小时后取下蜡膜小袋再次称重，两次质量之差分别为褐飞虱的蜜露分泌量。根据褐飞虱取食特定水稻品种后蜜露分泌量的多少可以确定该水稻品种对褐飞虱个体的抗性。评估结果如图2所示，褐飞虱个体取食对照品种tn1后具有最高的蜜露分泌量，且不同基因型之间无显著差异，也证明对照品种tn1对三种基因型的褐飞虱均无抗性。候选抗虫品种ir36对于genotype1的褐飞虱具有较高抗性，但是对于genotype2的褐飞虱抗性较弱，因此可以认为其在田间已不具有适用性。候选的抗虫品种r.h.对于所有三种基因型的褐飞虱均具有较高抗性，因此其可作为有效的抗虫品种，但genotype2的褐飞虱取食r.h.的蜜露量显著高于genotype1的褐飞虱，说明r.h.品种今后存在抗虫性失效的风险，此结果与张扬等的研究结果一致(张扬,肖汉祥,李燕芳,等.国际水稻研究所抗褐稻虱品种资源的抗性鉴定与抗性株系筛选[j].广东农业科学,2011(21):28-30.)。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<120>一种基于褐飞虱特定致害性基因型评估抗虫水稻品种潜在适用性的方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cattattcatacagatttgatggagag27<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cactaggtgtcaaatctacaaacc24<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tcgaaggtgagttgtttgttttgt24<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4agccctaaagagaaaagagacaatgt26<210>5<211>845<212>dna<213>褐飞虱(nilaparvatalugens)<400>5atcgaaggtgagttgtttgttttgttcaatcgttatatcgtattatctcattgctacggt60tagttggtaacagtactgtgtaggacgcaaatgaaagaactacgtctgaacaaaagatag120agtcaaatgctgccggtttctgtccaactaaaaattccagtcaaacttcacctataccgg180tgctgtagttgtgttcagaactattcaatttggaagaaaaatagcacaaggactacctta240taattttatctaccaatgtaatagcattagtgtcatttgcattgtaaataaataaaaaat300agataaaataaaataaccttgaatgttttatgtatcacacataaatgattcttttataat360ctaaatttgtgagtggaatatcaaagagctcgtctgttttttgttctttcaatatgattt420tgatgataaataattttgcacttatgaatacatgaataccgtaactttattattagagat480aatccatagttactagtcagattcatttataatagtcgtaataaataaacgatgactgca540agtgtattactcatatttattgaacattgtctcttttctctttagggctacttttgaata600taaataaacatataaatctaagtacccctttcaaaattataataaattttaattttaaat660acggtatctacttggatttatatgtttatctattgaacattatttgaagccatttaaaca720tgtataagggagctgaatgtcaagttgctatagcatattttaatttgacccatttaaatt780ttgactcatgtttcaatttttggaaaattaaacaatatcacgcttcaacttatgcatgat840accag845<210>6<211>999<212>dna<213>褐飞虱(nilaparvatalugens)<400>6tattttttttcaagtacctacagtatataattaatttattttctccatgttgtccatatg60tgatacataattattataaaatgaatattgtttgctatgcgactactccccgcacacgga120catgtcatccaaattgggagcctatgatcatatttattaattttatgtaaatttcattgt180attttaaatgaatgaataaatttaatttgatttgatttgaatatttttttcaaaaataaa240tttaaaaaatattaagatgtgtactctctctacttgacataatcagtagcgtattaccaa300acaagattattgttttttttttcaaattctatgcaaatcttcctcattattcatacagat360ttgatggagagcctatatatcacacacatggaaagaaagagaggaatttcaattcggaga420ttcaatcgacgattgtacggaatggagatataacatcagtgcacacaatcaggttaactg480cgaaatgcgttgcagatttgaaagaatggcccagagatagggccacgtgtgaagctttca540ttggtgctcaagctattcagaatatcaatttaa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