一种黄瓜组成型启动子及其应用

1.本发明涉及一种黄瓜组成型启动子及其应用，属于基因工程领域。


背景技术：

2.黄瓜是世界上最重要的蔬菜作物之一，2019年中国黄瓜产量达到7033.9万吨，占世界总产量的八成以上，在我国国民生产中具有举足轻重的地位。同时，作为第一个完成全基因组测序的蔬菜作物，自2009年以来其功能基因组相关研究不断推进，越来越多的功能基因得到克隆和解析。然而，与之相较的是黄瓜中启动子的相关研究却较为滞后，这也逐渐成为进一步开展功能基因研究的制约因素。
3.启动子一般是指位于结构基因5ˊ端上游的一段rna聚合酶特异性识别和结合的dna序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化rna聚合酶，启动基因转录。rna聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。启动子(promoters)就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸(nucleotides)，那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。
4.分离并鉴定黄瓜中的启动子，特别是组成型表达基因的启动子，用以驱动黄瓜中基因的表达或驱动外源基因在黄瓜植株中表达用于通过基因工程的方式改良黄瓜材料，可能会更加稳定、高效，对于推动黄瓜功能基因组的研究和基因工程的应用具有极为重要的作用


技术实现要素：

5.本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种黄瓜组成型启动子及其应用。一种黄瓜组成型表达的启动子，该启动子来源于黄瓜csef1α基因上游，可以替换植物表达载体pbi121上的camv35s启动子，构建成新的植物表达载体，将这个表达载体转入植株中可以实现在不同植物的植株的所有组织中进行表达。
6.一种黄瓜组成型启动子，其序列如seq id no.1所示。
7.一种含有上述的启动子的重组载体，上述启动子的序列替换植物表达载体pbi121上的camv35s启动子构成重组载体pbi-csef1αpro。
8.进一步的，上述csef1α的序列如seq id no.6所示。
9.上述植物表达载体pbi121为下游含有β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)标签的pbi121载体。
10.一组用于扩增上述的启动子的引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所述，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所述。
11.上述黄瓜组成型启动子、重组载体或引物实现在植物整个植株每个组织中均表达的应用。
12.进一步的，上述植物指拟南芥、烟草、小麦、水稻、玉米、棉花、油菜、大豆、番茄、黄
瓜和甜瓜中的一种。
13.有益效果：
14.(1)黄瓜组成型启动子来源于黄瓜csef1α基因上游，替换植物表达载体pbi121上的camv35s启动子，构建成新的植物表达载体，将这个表达载体转入植株中可以实现在不同植物的植株的所有组织中进行表达。
15.(2)将含有黄瓜组成型启动子的植物表达载体pbi121通过真空渗透法转化模式作物拟南芥成功获得了转基因阳性植株，组织gus染色后呈蓝色非转基因植株不能染色。
附图说明
16.图1黄瓜组成型启动子的表达载体构建。
17.图2载体pbi-csef1αpro的检测结果。
18.图3黄瓜组成型启动子驱动gus基因在拟南芥组织表达的染色图。
具体实施方式
19.为了使本技术领域人员更好地理解本技术中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。
20.实施例1：黄瓜转录延伸因子基因csef1α启动子的克隆和植物表达载体的构建
21.本实施例中通过对黄瓜参考基因组序列进行分析确定这个基因的转录起始位点，利用高保真pcr聚合酶(phusiontm high-fidelity dna polymerse，购自new england biolads公司)分离基因上游非翻译区(即包含该基因启动子区域)约1.5kb的片段，pcr扩增的反应体系是：
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pcr循环参数为94℃(30s)－58℃(30s)－72℃(1min)，共32个循环。1.2％琼脂凝胶检测扩增产物。
[0025]
将扩增片段克隆到pmd18-t(购自宝生物工程大连有限公司)载体上，测序结果表明序列完全准确，没有错配碱基存在。提取插入片段序列正确的克隆的融合质粒，分别用hindⅲ和kpnⅰ酶切组合处理质粒和双元载体pbi121(jefferson,r.a.,t.a.kavanagh,and m.w.bevan,gus fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.embo j,1987.6(13):p.3901-7)，分别回收目标片段后
连接并转化大肠杆菌dh5α(购自宝生物工程大连有限公司)，在含有50ug/ml卡那霉素的lb培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，酶切检测准确的克隆所包含的载体就是包含正确启动子的融合载体pbi-csef1αpro。载体如图2所示，m指maker，1为包含正确启动子的融合载体pbi-csef1αpro，2为空载体。
[0026]
实施例2：pbi-csef1αpro转基因拟南芥植株的获得和gus组织染色
[0027]
构建的启动子分析载体用农杆菌沾花的方法转化拟南芥野生型植株(zhang,x.r.,et al.,agrobacterium-mediated transformation of arabidopsis thaliana using the floral dip method.nature protocols,2006.1(2):p.641-646)。在含25mg/l卡那霉素的ms固体培养基上筛选转化拟南芥植株的种子。
[0028]
转基因的拟南芥即抗性植株根长，植株较大，子叶和真叶的颜色为鲜绿色；非转基因植株根很短，植株矮小，子叶黄化。当转基因植株长到3－5片真叶后移植到土中培养，得到约20株转基因植株。提取转基因阳性植株叶片总dna(stewart,c.n.,et al.,1993)，用pbi121载体(图1)上存在的nptⅱ基因的cds序列设计的引物npt-f(seq id no.4)和npt-r(seq id no.5)，通过pcr进一步鉴定转化植株。
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pcr扩增的反应体系是：
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pcr循环参数为94℃(30s)－58℃(30s)－72℃(1min)，共32个循环。1.2％琼脂凝胶检测扩增产物。
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取不同发育时期的转化植株用90％丙酮处理后，再用x-glu染色液在37℃避光条件下染色过夜，用70％浓度的酒精脱色后观察，发现具有pbi-csef1αpro遗传背景的拟南芥植株有gus着色信号(见图3)。图3中的a为播种7天的拟南芥幼苗；图3中的b为播种20天的拟南芥幼苗；图3中的c为未开放的花蕾；图3中的d为开放的花朵。在植株的根茎叶花等各组织中均能检测到gus基因的表达，该启动子驱动gus基因染色，整株均可实现染色，因此，证明启动子为组成型表达，该启动子可以实现在植株中全部组织的表达。
[0034]
在本发明所提及的所有文献都在本技术中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明所讲述内容后，本领域的技术人员可以对本发明做各种改动或者修改，这些等价形式同样属于本技术所附的权利要求书所限定的范围。