一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术邻域，具体涉及一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液。


背景技术：

2.目前对于新冠病毒等感染，最主要的检测方法是核酸检测。核酸检测第一步是样本采集，即将受试者的鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液及粪便等样本放入病毒保存液中，进行运输或保存。目前病毒保存液液主要分两大类：非灭活型病毒保存液，主要保证病毒的完整性；灭活型病毒保存液，主要灭活病毒但保证其核酸的完整性。在实际操作过程中，由于灭活型病毒保存液安全性高，受到一线医护人员的欢迎。
3.最初灭活型病毒保存液一般为无色液体，不便于观察液面位置，甚至有时出现渗漏而未被察觉的情况。所以，卫健委对新冠核酸保存液提出具备“易于观察、辨识的颜色”的要求。基于此要求，厂商纷纷在灭活型病毒保存液中加入酚红试剂，使保存液颜色变为红色。然而，在灭活型病毒保存液中加入酚红有以下缺点：一，与非灭活型病毒保存液颜色相同，容易混淆。目前非灭活型病毒保存液主要成分是hanks液，其中含有酚红作为即时ph指示剂。许多厂商并未在采集管上明确标明保存液类型是灭活型还是非灭活型，如果两者颜色都为红色，则容易出现混淆。两种保存液在后续核酸提取、pcr反应操作中存在一些差异，如灭活型病毒保存液中保存的样本必须进行核酸的提取，而不能使用“核酸释放剂”等免提取的手段。二，灭活型病毒保存液加入酚红会出现颜色不稳定。酚红的作用是即时 ph指示剂，其在非灭活型病毒保存液中的作用为：如果保存管已使用，或者被污染，则管内溶液ph下降，导致酚红颜色从红色变为黄色。而灭活型病毒保存液在很广的ph范围内都可以工作。如主要成分为异硫氰酸胍的灭活型病毒保存液，在ph5
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8的范围内都可以很好的灭活病毒、保存核酸。而在这个ph范围内，酚红将会呈现出黄色、橘黄色、粉红色以及红色等不同的颜色。这样的色差虽然不会对使用产生影响，但有时会使一线医护人员及受试者产生困扰。
4.因此，急需开发一种新型的灭活型病毒保存液，具有以下特征：(1)有效的灭活病毒、保存病毒核酸；(2)加入染料，满足卫健委“易于观察、辨识的颜色”的要求，且染料颜色区别于酚红的红色，且其颜色不受ph变化而改变；(3)加入染料后不影响核酸提取及荧光定量pcr反应。


技术实现要素：

5.由此可见，本发明提供一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液, 其保存液可常温运输无需低温，采集样本后样本进入保存液后即刻灭活， rna在常温数天内不会被降解。并进一步的做出技术改进，保存液呈现绿色，便于观察液面位置及液体渗漏，且不影响保存液效果。
6.本发明保存液包括：缓冲稳定剂10
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1000mm/l，蛋白变性剂100
‑ꢀ
8000mm/l，核酸酶抑制剂1
‑
100mm/l，表面活性剂1
‑
100mm/l，绿色染料0.05
‑
1mm/l组成。
7.上述技术方案中，进一步阐述：缓冲稳定剂为乙酸钠，三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸钠，甘氨酸，甘露醇中一种或几种。
8.上述技术方案中，进一步阐述：蛋白变性剂为盐酸胍、异硫氰酸胍、脲中的一种或几种。
9.上述技术方案中，进一步阐述：核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸 (edta)，乙二醇双(2
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氨基乙基醚)四乙酸(egta)，焦磷酸二乙脂，氧钒核糖核酸复合物，dtt，硅藻土中的一种或几种。
10.上述技术方案中，进一步阐述：表面活性剂为十二烷基硫酸钠(sds), 乙基苯基聚乙二醇(np
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40)，十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，曲拉通 x
‑
100中一种或几种。
11.上述技术方案中，进一步阐述：绿色染料为固绿(fcf)。
12.本发明的保存液能够有效的灭活病毒，保护医护人员的安全，并且可以在常温环境防止核酸降解，适用于取样后常温运输。本保存液含有绿色染料固绿，可以帮助医护人员清晰地辨认出液面位置，便于后续实验操作。
附图说明
13.图1本发明的含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液灭活病毒效果。从左到右分别为：生理盐水+ibv病毒接种鸡胚，实施例一保存液+ibv病毒接种鸡胚，实施例二保存液+ibv病毒接种鸡胚。
14.图2本发明的含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液保存病毒核酸的效果。
具体实施方式
15.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
16.实施例一：
17.保存液的制备：称取异硫氰酸胍472.64g，柠檬酸二钠7.5g，乙二胺四乙酸二钠0.75g，曲拉通x
‑
100 2ml，固绿0.079g,加入双蒸水定容至1l，使得异硫氰酸胍的终浓度为4m/l，柠檬酸二钠的最终浓度为25mm/l，乙二胺四乙酸二钠的最终浓度为2mm/l，曲拉通x
‑
100的最终浓度为 8mm/l,固绿的最终浓度为0.1mm/l。配制完成后，将溶液通过0.25μm的滤膜除菌。
18.实施例二：
19.保存液的制备：称取脲24g，无水乙酸钠32.8g，乙二胺四乙酸二钠 3.7g，十二烷基硫酸钠2.88g，三羟甲基氨基甲烷2.42g，固绿0.079g,加入双蒸水定容至1l，使得脲的终浓度为400mm/l，无水乙酸钠的最终浓度为400mm/l，乙二胺四乙酸二钠的最终浓度为10mm/l，十二烷基硫酸钠的最终浓度为10.4mm/l,三羟甲基氨基甲烷的最终浓度为20mm/l,固绿的最终浓度为0.1mm/l。配制完成后，将溶液通过0.25μm的滤膜除菌。
20.实施例三：
21.本发明的保存液灭活病毒的效果评估：将制备好的鸡传染性支气管炎病毒(ibv)qxl87株种毒添加至保存液中，按1(病毒原液)：10(保存液)比例，置室温18
‑
26℃灭活
30min；将灭活好的病毒液接种spf鸡胚进行灭活检验。如图1所示，本发明实施例一与实施例二的含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液能够很好的灭活ibv病毒，使得鸡胚能够正常发育，而对照组生理盐水不能灭活ibv病毒，导致接种后鸡胚死亡，停止发育。
22.实施例四：
23.本发明的保存液保存病毒核酸的效果评估：将ibv病毒培养原液分别用3种不同的保存液(无色胍盐类核酸保存液、本发明实施例一保存液，本发明实施例二保存液)按10的倍数稀释3个梯度。将稀释好的病毒样本分别保存于室温7d后取样，直接进行rna提取，提取后使用ibv病毒核酸检测试剂盒进行检测。如图2所示，无色胍盐类核酸保存液、本发明实施例一保存液，本发明实施例二保存液都能有效的灭活病，绿色染料对灭活型保存液灭活病毒的效果没有影响。


技术特征：
1.一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：主要由缓冲稳定剂10
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1000mm/l，蛋白变性剂100
‑
8000mm/l，核酸酶抑制剂1
‑
100mm/l，表面活性剂1
‑
100mm/l，绿色染料0.05
‑
1mm/l组成。2.根据权利要求1所述的一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：缓冲稳定剂为乙酸钠，三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸钠，甘氨酸，甘露糖中一种或几种。3.根据权利要求1所述的一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：蛋白变性剂为脲、异硫氰酸胍、盐酸胍、硫酸铵中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：表面活性剂为十二烷基硫酸钠、曲拉通x
‑
100、吐温20中的一种或几种。5.根据权利要求1所述的一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸(edta)，乙二醇
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双
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(2
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氨基乙醚)四乙酸(egta)，环已烷二胺四乙酸(cdta)中的一种或几种。6.根据权利要求1所述的一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液，其特征在于：绿色染料为固绿(fcf)。

技术总结
一种含有绿色染料的灭活型病毒核酸保存液，主要包含以下主要成分：缓冲稳定剂10


技术研发人员：张冬平 张珉艳 黄艳
受保护的技术使用者：扬州万禾生物科技有限公司
技术研发日：2021.07.26
技术公布日：2021/11/29