一种用于检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素A和B的引物组合、探针组合和检测方法与流程

no.3)，
9.肠毒素a基因sea反向引物：5
’‑
tggatcttcaagcaagacgttat
‑3’
(seq id no.4)，
10.肠毒素b基因seb正向引物：5
’‑
gggaatgttggataaaggagataaaaa
‑3’
(seq id no.5)，
11.肠毒素b基因seb反向引物：5
’‑
tgtgcaactcatctggtttagga
‑3’
(seq id no.6)。
12.本发明进一步提供和所述引物组合配套使用的探针组合，包括：
13.种特异基因nuc探针：5
’‑
fam
‑
tgatacgccagaaacggtgaaaccg
‑
bhq1
‑3’
(seq id no.7)，
14.肠毒素a基因sea探针：5
’‑
fam
‑
aatcccctctgaaccttcccatcaaaaac
‑
bhq1
‑3’
(seq id no.8)，
15.肠毒素b基因seb探针：5
’‑
hex
‑
acacccaacgttttagcagagagtcaacca
‑
bhq1
‑3’
(seq id no.9)。
16.第二方面，本发明提供一种试剂盒，包括所述引物组合和所述探针组合。
17.第三方面，本发明提供一种检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素a和b的方法，包括：
18.(1)提取待测样品的基因组dna；
19.(2)以所述基因组dna为模板，利用权利要求1所述引物组合和权利要求2所述探针组合进行pcr扩增；
20.(3)根据pcr扩增结果判断所述待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌及其肠毒素a和b。
21.进一步地，所述nuc pcr扩增的反应体系，以20μl计包括：
22.nuc pcr体系：基因组dna1μl，10μm nuc正、反引物各1.6μl，10μm nuc探针0.6μl，2
×
ddpcr supermix for probes 10μl，ddh2o补足至20μl；
23.sea,seb pcr体系：基因组dna 1μl，10μm肠毒素a基因正、反引物各1μl，10μm肠毒素a基因探针0.4μl，10μm肠毒素b基因正、反引物各1.2μl，10μm肠毒素b基因探针0.3μl，2
×
ddpcr supermix for probes 10μl，ddh2o补足至20μl。
24.进一步地，所述pcr扩增的反应程序包括：
25.nuc:95℃预变性600s；94℃变性30s，57℃退火60s，共40个循环；98℃延伸600s。
26.sea,seb:95℃预变性600s；94℃变性30s，56℃退火60s，共40个循环；98℃延伸600s。
27.进一步地，步骤(3)具体为：
28.记录反应体系中的荧光信号值，通过泊松分布公式计算反应体系中种特异基因nuc、肠毒素a和肠毒素b的拷贝数。
29.本发明进一步提供所述引物组合、所述探针组合和所述试剂盒在检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素a和b中的应用。
30.进一步地，所述应用为检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素a和b；优选为检测牛奶中金黄色葡萄球菌及其肠毒素a和b。
31.本发明具备如下有益效果：
32.本发明提供的引物组合和探针组合，以及配套的方法可以直接对样品中的金葡菌特异基因nuc和肠毒素a、肠毒素b基因进行绝对定量检测，本方法定量检测限nuc数字pcr最
低能检出5.07
±
3.03拷贝/20μl，肠毒素a数字pcr最低能检出6.20
±
1.48拷贝/20μl，肠毒素b数字pcr最低能检出4.36
±
1.95拷贝/20μl。牛奶标本检出限为103cfu/ml，能满足实际检测的需要，是一种金葡菌及其肠毒素a和b检测的有效方法。
附图说明
33.图1为本发明实施例1提供的多组引物对的双重数字pcr扩增结果。
34.图2为本发明实施例3提供的肠毒素a基因的拷贝数检测结果。
35.图3为本发明实施例3提供的肠毒素b基因的拷贝数检测结果。
36.图4为本发明实施例3提供的金黄色葡萄球菌特异基因nuc的拷贝数检测结果。
37.图5为本发明实施例3提供的牛奶模拟样本中肠毒素a基因的检测结果。
38.图6为本发明实施例3提供的牛奶模拟样本中肠毒素b基因的检测结果。
39.图7为本发明实施例3提供的牛奶模拟样本中金黄色葡萄球菌特异基因nuc的检测结果。
具体实施方式
40.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
41.实施例1用于金葡菌种特异基因nuc，肠毒素a和肠毒素b的双重数字pcr定量检测的引物和探针组合的设计
42.本发明首先根据肠毒素a(sea)，肠毒素b(seb)，金葡菌种特异基因nuc的基因序列进行引物设计，在用常规软件设计得到的肠毒素a基因sea的3套引物探针与肠毒素b基因seb的引物和探针的兼容性差，无法得到双重数字pcr扩增结果。
43.进一步，本发明通过采用肠毒素a基因的互补序列为模板，根据以往设计探针经验，人为设计了一条探针，获得了较好的双重数字pcr扩增效率。本发明采用104拷贝的sea、seb质粒作为模板，用4套不同的sea引物探针分别与seb的一套引物和探针配对进行双重数字pcr。结果发现只有后续人为设计的sea引物和探针有扩增，其余未见扩增。结果如图1所示，其中a为4套sea引物探针的数字pcr扩增结果；b为seb引物探针的数字pcr扩增结果。
44.上述人为设计的用于金葡菌种特异基因nuc，肠毒素a和肠毒素b,双重数字pcr荧光定量检测的引物和探针组合，具体如下：
45.针对金黄色葡萄球菌特异基因nuc：
46.种特异基因nuc正向引物：5
’‑
tcaaagagttgtggatggtgatac
‑3’
；
47.种特异基因nuc反向引物：5
’‑
cttctttgccaaatggttgtacag
‑3’
；
48.种特异基因nuc探针：5
’‑
fam
‑
tgatacgccagaaacggtgaaaccg
‑
bhq1
‑3’
；
49.针对肠毒素a，具体如下：
50.肠毒素a基因正向引物：5
’‑
ccgaaggttctgtagaagtatgaaaca
‑3’
；
51.肠毒素a基因反向引物：5
’‑
tggatcttcaagcaagacgttat
‑3’
；
52.肠毒素a基因探针：5
’‑
fam
‑
aatcccctctgaaccttcccatcaaaaac
‑
bhq1
‑3’
；
53.针对肠毒素b，具体如下：
54.肠毒素b基因正向引物：5
’‑
gggaatgttggataaaggagataaaaa
‑3’
；
55.肠毒素b基因正向引物：5
’‑
tgtgcaactcatctggtttagga
‑3’
；
56.肠毒素b基因探针：5
’‑
hex
‑
acacccaacgttttagcagagagtcaacca
‑
bhq1
‑3’
。
57.实施例2金葡菌种特异基因nuc，肠毒素a和肠毒素b的双重数字pcr定量检测方法的建立
58.1、实验材料
59.使用的金黄色葡萄球菌菌株bj0308和菌株1013333，均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。qubit4 fluorometer购自invi trogen公司。qx200微滴式数字pcr系统及所用耗材均购自bio
‑
rad公司。
60.2、牛奶样品基因组dna的提取
61.(1)将新鲜培养的金黄色葡萄球菌菌株用生理盐水调至1od，系列稀释后菌落计数；
62.(2)用牛奶系列稀释1od的菌悬液，获得各个浓度梯度的牛奶菌悬液；
63.磁珠法：
64.(3)取200μl牛奶样本加入2ml含玻璃珠的研磨离心管中，使用四维旋转混匀仪涡旋混匀(40hz 240s)；
65.(4)取出研磨离心管，取200μl上清液至2ml新离心管；
66.(5)加入700μl核酸吸附液、20μl蛋白酶k溶液(20mg/ml)、30μl提取磁珠，置于旋转混和仪，温和混匀30min，磁分离架吸附磁珠，弃上清；
67.(6)加入600μl洗涤液i洗涤磁珠，颠倒混匀洗涤5min,吸附磁珠，弃上清；
68.(7)加入600μl洗涤液ii洗涤磁珠2min,吸附磁珠，弃上清；
69.(8)加入600μl70％乙醇洗涤磁珠2min,吸附磁珠，弃上清；
70.(9)重复上述步骤8；
71.(10)吸附磁珠，弃上清后静置5min,去除乙醇残留；
72.(11)加入100μl洗脱液，混和均匀，洗脱10min；
73.(12)磁场吸附磁珠，回收含基因组dna的洗脱液至另一干净离心管内，进行dna检测及后续实验。
74.离心柱法：
75.(3)取200μl牛奶样本加入1.5ml离心管中，14000rpm离心2min，弃去上层乳脂层；
76.(4)加入100μl solution a,5μl溶葡萄球菌酶(1mg/ml)，37℃孵育45min；
77.(5)加入300μl buffer sk,10μl蛋白酶k(20mg/ml)，混匀后55℃震荡孵育45min；
78.(6)加入200μl无水乙醇，混匀后取出全部液体至dneasy minispin column中，14000rpm离心2min，弃去滤过液体；
79.(7)将dneasy mini spin column旋转180
°
，14000rpm离心2min，弃去滤过液体；
80.(8)加入500μl buffer sk，14000rpm离心2min，弃去滤过液体；
81.(9)加入500μl wash solution a，14000rpm离心2min，弃去滤过液体；
82.(10)重复上述步骤9；
83.(11)14000rpm干燥离心2min，将dneasy mini spin column放入新的离心管中；
84.(12)将100μl elution buffer b加入dneasy mini spin column，2000rpm离心2min，再14000rpm离心1min收集滤液备用。
85.3、数字pcr扩增反应
86.(1)配制体系：20μl体系包括10μl 2
×
ddpcr supermix for probes,基因组dna1μl，10nm sea基因正、反引物各1μl(终浓度500nm)，10nm sea基因探针0.4μl(终浓度200nm)，10nm seb基因正、反引物各1.2μl(终浓度600nm)，10nm seb基因探针0.3μl(终浓度150nm)，ddh2o补足至20μl；混匀离心。
87.(2)生成微滴：将一个新的dg8 cartridge放入holder中，将配制好的20μl体系全部加入dg8 cartridge的sample孔中，取70μl dg oil加入dg8 cartridge的oil孔中，盖上gasket后置于qx200 droplet generator中生成微滴。
88.(3)封板：将生成的微滴转移至96孔板，用预热好的px1热封仪180℃6s，将铝膜封膜于96孔板上。
89.(4)pcr扩增：将封板后的96孔板置于pcr仪上，按95℃预变性600s；94℃变性30s，56℃退火60s，共40个循环；98℃延伸600s程序扩增。
90.(5)微滴分析：将扩增完全的96孔板置于qx200 droplet reader中进行检测，使用quantasoft 1.7.4软件进行数据分析。
91.4、数据分析
92.将quantasoft 1.7.4软件中检测分析的结果导出即为数字pcr检测结果。
93.5、数字pcr反应体系特异性验证
94.用16个其他种细菌进行特异性验证，nuc，sea,seb均为阴性。
95.表1数字pcr检测结果
[0096][0097]
实施例3金葡菌种特异基因nuc，肠毒素a和肠毒素b的双重数字pcr定量检测方法的检测限
[0098]
本实施例确定实施例2提供的定量检测方法的检测限，具体如下：
[0099]
1、质粒标准品：使用qubit4 fluorometer测定质粒标准品浓度，运用拷贝数计算
公式【拷贝/μl＝(6.02*10
23
拷贝数/摩尔)*(ng/μl*10
‑9)/(dna长度*660))】计算出拷贝数，将quantasoft 1.7.4软件中检测分析的结果导出，在microsoft office excel中以质粒标准品拷贝数的对数为x轴，以数字pcr实际检测拷贝数的对数为y轴，做拟合曲线。
[0100]
2、牛奶模拟样本：用生理盐水将1od菌液系列稀释，取100μl的稀释至10
‑6、10
‑7倍数的菌液进行过夜培养，计算菌落数，将quant asoft 1.7.4软件中检测分析的结果导出，在microsoft office excel中以样本绝对菌落数的对数为x轴，以数字pcr实际检测拷贝数的对数为y轴，做拟合曲线。
[0101]
3、结果分析：
[0102]
3.1、将构建好的质粒标准品(1
×
108拷贝/μl)，用纯水10倍系列稀释得到介于1
×
101－1
×
107拷贝/μl之间的系列参考品为模板，进行数字pcr检测，结果如表2
‑
表4，图2
‑
图4所示，结果显示：
[0103]
sea数字pcr最低能检出6.20
±
1.48拷贝/20μl的核酸片段，seb数字pcr最低能检出4.36
±
1.95拷贝/20μl，nuc数字pcr最低能检出5.07
±
3.03拷贝/20μl。
[0104]
表2 sea质粒双重数字pcr检测拷贝数
[0105][0106]
表3 seb质粒双重数字pcr检测拷贝数
[0107][0108]
表4 nuc质粒双重数字pcr检测拷贝数
[0109][0110]
3.2、数字pcr最低在2
×
103cfu/ml的金葡菌牛奶模拟样本中检测出结果，此时的绝对cfu为4，结果如表5
‑
表7、图5
‑
图7所示：sea：14.60
±
0.63拷贝/20μl、seb：8.68
±
2.67拷贝/20μl、nuc：16.80
±
2.40拷贝/20μl。
[0111]
表5肠毒素a牛奶模拟样本数字pcr结果
[0112][0113]
表6肠毒素b牛奶模拟样本数字pcr结果
[0114][0115][0116]
表7 nuc牛奶模拟样本数字pcr结果
[0117][0118]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。