一种检测CircCDR1as基因或蛋白的产品及应用

一种检测circcdr1as基因或蛋白的产品及应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤分子标志物技术领域，具体涉及一种检测circcdr1as基因或蛋白的产品，还涉及rbp1基因或蛋白制备抑制多形性腺瘤的增殖、迁移和侵袭的药物中的应用。


背景技术：

2.多形性腺瘤是唾液腺最常见的肿瘤，约占所有上皮性唾液腺肿瘤的50％。多形性腺瘤的病理形态多样，由上皮和改变的肌上皮成分混合粘液或软骨成分组成。虽然是良性肿瘤，但在不完全手术切除后，也有复发的倾向，甚至有转化为恶性肿瘤的可能性。
3.据报道，上皮
‑
间充质转化(emt)或转分化促进了多形性腺瘤的组织发生和发展，肿瘤上皮细胞可转分化为间充质细胞，导致多形性腺瘤的形态异质性。细胞角蛋白7，14、e
‑
cadherin、wt
‑
1、a
‑
sma、s
‑
100等这些因子在多形性腺瘤不同部位表达水平有差异。
4.cirs
‑
7也被称为小脑退化相关蛋白1反义rna(cdr1as)，是一种环状rna，主要存在于人类和小鼠的大脑中。自然状态下以反义rna链的形式出现，形成一个闭环结构。circcdr1as作为microrna
‑
7的海绵或竞争内源rna(cerna)，对乳腺癌、肝癌、宫颈癌等多种癌症的发生发展具有巨大的积极作用。最近，circcdr1as被发现在喉鳞状细胞癌中促进细胞生长和emt表型的形成。circcdr1as在多形性腺瘤中尚无研究。这些研究结果提示，circcdr1as在促进肿瘤转移方面起到重要作用，提示circcdr1as在多形性腺瘤的诊断和治疗中具有巨大潜力。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一种检测circcdr1as基因或蛋白的产品，用于辅助诊断多形性腺瘤。
6.本发明的第二个目的是提供circcdr1as基因或蛋白制备抑制多形性腺瘤的增殖、迁移和侵袭的药物中的应用。
7.本发明所采用的技术方案是，一种检测circcdr1as基因或蛋白的产品，产品包括检测circcdr1as基因或蛋白的表达水平的产品。
8.本发明所采用第一种技术方案的特点还在于:产品包括能够结合circcdr1as基因的核酸或者能够与circcdr1as蛋白的结合蛋白物质，核酸能够检测circcdr1as基因的表达水平，蛋白物质能够检测circcdr1as蛋白的表达水平。
9.核酸是实时定量pcr中使用的特异扩增circcdr1as基因的序列，序列如seq id no.1所示。
10.产品能够检测受试者样本中的circcdr1as基因或蛋白的表达水平，当其表达水平下调，考虑腺体组织为多形性腺瘤。
11.本发明的第二种技术方案是：一种circcdr1as基因或蛋白在制备抑制唾液腺多形性腺瘤增殖、迁移和侵袭的药物中的应用。
12.本发明的有益效果是：本发明运用itraq技术筛选检circcdr1as基因，分别在多形
性腺瘤和正常组织中检测了circcdr1as的表达水平。定量rt
‑
pcr显示circcdr1as基因在肿瘤组织中表达下调，western blot结果显示circcdr1as蛋白在细胞系中低表达，组织中免疫组化实验显示多形性腺瘤中circcdr1as较正常组织中低表达。因此，可以运用circcdr1as辅助诊断多形性腺瘤。本发明为多形性腺瘤的诊断提供有效的生物学标记物，对多形性腺瘤的早发现、早治疗具有重要的临床意义。
13.此外，还对circcdr1as设计并合成可促进circcdr1as表达的引物序列，在多形性腺瘤细胞系中将circcdr1as过表达，且发现过表达该基因可抑制多形性腺瘤的增殖、侵袭与迁移能力。因此，针对该基因的抑制剂也具有多形性腺瘤临床治疗的潜力。
附图说明
14.图1是本发明采用rt
‑
pcr的方法检测pa及正常组织中circcdr1as的表达水平；
15.图2是本发明采用免疫组化检测emt相关转录因子在pa中表达水平；
16.图3是本发明采用western blot检测对正常腺体组织及pa中e
‑
cadherin、间质标记物vimentin以及emt相关分子snail、slug、twist、zeb1的表达水平；
17.图4是pa细胞系中过表达circcdr1as后检测e、v、及emt相关转录因子的表达水平。
具体实施方式
18.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
19.实施例1：采用rt
‑
pcr的方法检测pa及正常组织中circcdr1as的表达水平；
20.步骤1、从临床中选取的20对多形性腺瘤与正常腺体组织中提取总rna，称取1ug的rna逆转录为cdna：
21.(1)逆转录体系为：
[0022]5×
gdna eraser buffer 2μl
[0023]
gdna eraser 1μl
[0024]
rna 1μg
[0025]
室温孵育大于5min
[0026]
primescript rt enzyme mixⅰ1μl
[0027]
rt primer mix 1μl
[0028]5×
primescript buffer 2 4μl
[0029]
rnase
‑
free h2o 4μl
[0030]
(2)反应条件：37℃条件下金属浴15min，85℃条件下金属浴5s，得到cdna后测定浓度；
[0031]
步骤2、将步骤1获得的cdna进行实时定量pcr：
[0032]
(1)pcr反应体系为：
[0033]
tb green premix ex taqⅱ7.5μl
[0034]
forward
‑
primer 1μl
[0035]
reverse
‑
primer 1μl
[0036]
cdna 1μl
[0037]
ddh2o 4.5μl
[0038]
total 15μ
[0039]
(2)反应条件为：pcr仪器中95℃条件下30s，40个循环
×
(95℃5s，60℃30s)。
[0040]
以tb green作为荧光标记物，将ct值使用2
‑
δδct
进行定量，获得基因的表达水平，表达结果如图1所示，由图1可知：图中normal代表正常组织，pa代表多形性腺瘤肿瘤组织，circcdr1as在多形性腺瘤组织中表达下调(*p＜0.05)。
[0041]
实施例2，采用免疫组化检测emt相关转录因子在pa中表达；
[0042]
步骤1、组织包埋
[0043]
取多形性腺瘤样本于4％福尔马林中固定，对样本组织进行脱水、石蜡包埋、再进行切片；
[0044]
步骤2、切片脱蜡
[0045]
将切片后的样品依次在二甲苯ⅰ中洗涤10min，二甲苯ⅱ中洗涤10min，无水乙醇中洗涤5min，95％乙醇中洗涤5min，80％乙醇中洗涤5min，最后纯水或pbs中洗涤3min(2次)；
[0046]
步骤3、抗原修复
[0047]
在步骤2得到的切片组织中加入配置好的柠檬酸抗原修复液，于微波炉中100℃加热3min，30℃加热10min，放置于室温下冷却，倒掉废弃修复液，pbs洗涤3min(2次)；
[0048]
步骤4、在步骤3得到的切片组织上滴加内源性过氧化氢酶阻断剂，于室温下孵育10min，pbs洗涤3min(2次)；
[0049]
步骤5、使用山羊血清在室温条件下封闭组织10min，甩干，接着滴加约0.2ml一抗工作液，在4℃条件下于湿盒中孵育过夜；次日，pbs洗涤一抗3min(2次)，滴加反应增强液，室温下孵育10min，pbs洗涤3min(2次)；滴加二抗，室温下孵育10min，pbs洗涤3min(2次)；
[0050]
步骤6、将步骤5的切片组织滴加dab染色液，室温下孵育2.5min显色，再用自来水洗涤；
[0051]
步骤7、使用苏木素对步骤6得到的切片组织染色30s，用pbs浸泡5s进行复染；
[0052]
步骤8、组织脱水
[0053]
将步骤7得到切片组织依次在80％的乙醇中洗涤5s，95％乙醇中洗涤3min，无水乙醇ⅰ中洗涤5min，无水乙醇ⅱ中洗涤10min，二甲苯ⅰ中洗涤10min，二甲苯ⅱ中洗涤10min，最后中性树胶进行封片，普通光学显微镜下采集照片。emt相关转录因子在pa中表达情况；如图2所示，免疫组化检测显示：较正常组织相比，sacc中e
‑
cadherin低表达，vimentin、snail、slug、zeb1及twist高表达。
[0054]
实施例3，采用western blot检测正常腺体组织及pa中e
‑
cadherin、间质标记物vimentin以及emt相关分子snail、slug、twist、zeb1等的表达水平；
[0055]
步骤1、在指数期增长时收集样品细胞，加入ripa裂解液，在0～4℃下裂解细胞，离心，收集上清总蛋白，测定蛋白浓度；
[0056]
步骤2、将步骤1获得的总蛋白以每孔20μg上样，通过sds
‑
page分散在12％凝胶上(250v恒压40min)，再转移到pvdf膜上(290ma恒流1h)；
[0057]
步骤3、室温下，使用pbst配置的5％脱脂奶粉封闭步骤2得到的样品2h，pbst洗涤三次，于4℃环境下一抗孵育过夜，孵育次日，pbst洗涤三次，室温下二抗孵育1h，进行化学发光显影，显影的结果如图3所示，较正常组织相比，pa中e
‑
cadherin低表达，而vimentin、snail、slug、twist、zeb
‑
1高表达。
[0058]
实施例4，为构建circcdr1as过表达质粒，从人类互补dna文库中扩增出circcdr1as基因的全序列，插入asisi和mlu i限制性位点，再克隆到penter载体中。本研究中所采用的引物由takara公司提供。采用western blot检测正常腺体组织及过表达circcdr1as的pa细胞系中e
‑
cadherin、间质标记物vimentin以及emt相关分子snail、slug、twist、zeb1等的表达水平；
[0059]
步骤1构建circcdr1as过表达质粒
[0060]
步骤1.1在细胞培养板中接种细胞，当细胞汇合度达到70％
‑
90％时开始转染。
[0061]
步骤1.2在转染之前，弃去旧培养基，更换新鲜不含fbs的培养基。
[0062]
步骤1.3使用不含fbs的培养基稀释3000试剂，充分混匀。
[0063]
步骤1.4使用不含fbs的培养基稀释dna，制备dna预混液，然后添加p3000
tm
试剂，充分混匀。
[0064]
步骤1.5在每管已稀释的3000试剂中加入稀释的dna(1:1)。
[0065]
步骤1.6室温孵育5min。
[0066]
步骤1.7加入dna
‑
脂质体复合物至细胞中。
[0067]
步骤1.8细胞培养箱中孵育细胞48h，然后分析转染细胞。
[0068]
步骤2检测e、v、及emt相关转录因子的表达。
[0069]
步骤2.1在指数期增长时收集样品细胞，加入ripa裂解液，在0～4℃下裂解细胞，离心，收集上清总蛋白，测定蛋白浓度；
[0070]
步骤2.2将步骤1获得的总蛋白以每孔20μg上样，通过sds
‑
page分散在12％凝胶上(250v恒压40min)，再转移到pvdf膜上(290ma恒流1h)；
[0071]
步骤2.3室温下，使用pbst配置的5％脱脂奶粉封闭步骤2得到的样品2h，pbst洗涤三次，于4℃环境下一抗孵育过夜，孵育次日，pbst洗涤三次，室温下二抗孵育1h，进行化学发光显影，显影的结果如图4所示，图4a通过qpcr验证circcdr1as过表，图4b和图4c显示：较正常组织相比，过表达circcdr1as后，其e
‑
cadherin高表达，而vimentin、snail、slug、twist、zeb
‑
1低表达。
[0072]
本发明中检测circcdr1as基因或蛋白的产品包括能够结合circcdr1as基因的核酸或能够结合circcdr1as蛋白的物质。其核酸分子(含扩增circcdr1as基因的引物及其探针)可通过化学合成或生物制备获得，其蛋白的产品包括能够特异性结合circcdr1as蛋白的抗体或其片段，并通过已知方法可实现其作用。本发明产品包括但不限于试剂盒、基因芯片、试纸等，也可以是产品的高通量测序平台。