一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法

本发明涉及分子生物学技术在微生物鉴定领域的应用，更具体地说，是一种基于分子生物学技术快速鉴定大肠埃希菌和泛菌dna的检测方法。

背景技术：

1、大肠埃希菌(escherichia coli,e.coli)和泛菌(pantoea)作为药品污染微生物中常见的细菌，为革兰氏阴性短杆菌，同属于肠道杆菌科。泛菌在自然界分布广泛，主要存在于水、土壤，最多见于植物。大肠埃希菌不仅分布广泛，还会产生有致病性的血浆凝固酶，引起人腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等症状。

2、传统方法中增菌培养、分离纯化、革兰染色、生化试验等鉴定技术耗时长、步骤较繁琐存在诸多不足之处。

3、随着分子生物学检测技术的发展，pcr技术具有敏感度高、特异性强、耗时短等优点，并在仪器设备、试剂耗材和基本操作都已十分成熟，但由于大肠埃希菌和泛菌同源性较高，普通pcr无法准确鉴别。本研究通过软件分析成功找到大肠埃希菌一处酶切位点，建立pcr-酶切技术，可以快速、准确的对大肠埃希菌进行鉴定，为无菌制药企业提供技术支持。

技术实现思路

1、本发明的目的是基于细菌16s rdna基因片段具有高度的保守性，使用dnaman对大肠埃希菌和泛菌16s rdna基因片段进行分析，发现大肠埃希菌和泛菌具有较高的同源性，且在大肠埃希菌16s rdna基因片段存在一个酶切位点(5’-a/agctt-3’)，而泛菌不存在此位点。据此建立pcr-酶切技术，通过pcr反应扩增出大肠埃希菌和泛菌相同大小的目的片段，在通过限制性内切酶hind iii对二者进行酶切鉴定，可将二者准确区分开。使用方便的大肠埃希菌与泛菌pcr-酶切检测试剂盒，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供其简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。

2、本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

3、一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法，其特征是，它包含：

4、1.特异性引物

5、基于我们发现的大肠杆菌酶切位点使用ncbi primer-blast 5.0设计一对特异性引物：

6、eco-425f(正向引物)：5'gtaatacggagggtgcaagc 3'

7、eco-425r(反向引物)：5'aaccacatgctccaccgctt 3'

8、2.阳性对照品

9、将大肠埃希菌和泛菌特异性dna片段进行凝胶回收、纯化、连接后转入大肠杆菌感受态细胞dh5α，蓝白斑实验筛选阳性克隆；以质粒dna为模板进行扩增，pcr产物送至生工生物工程有限公司测序验证，分析测序结果，并将提取的质粒经pcr鉴定后稀释一定浓度作为试剂盒的阳性对照品。

10、3.鉴定反应体系

11、鉴定反应体系45μl，包括pcr反应体系和酶切反应体系；阳性对照反应体系45μl；阴性对照反应体系45μl。

12、(1)鉴定反应体系：总体系为45μl，pcr反应体系(25μl)：2×taq pcr master mix12.5 μl，待检dna模板(10ng/μl)1μl，引物f、r(2.5ng/μl)各0.5μl，余为双蒸馏水。酶切反应体系(20μl)：取上述pcr产物10μl于ep管中，加入hind iii酶1μl，10×m buffer 2μl，余为双蒸馏水。

13、(3)阳性对照反应体系：总体系45μl，2×taq pcr master mix 12.5μl，大肠埃希菌克隆质粒dna模板(10ng/μl)1μl，引物f、r(2.5ng/μl)各0.5μl，10.5μl双蒸馏水，取上述pcr产物10μl于ep管中，加入hind iii酶1μl，10×m buffer 2μl，余为双蒸馏水。

14、(4)阴性对照反应体系：总体系45μl，2×taq pcr master mix 12.5μl，泛菌克隆质粒 dna模板(10ng/μl)1μl，引物f、r(2.5ng/μl)各0.5μl，10.5μl双蒸馏水，取上述pcr产物10μl于ep管中，加入hind iii酶1μl，10×m buffer 2μl，余为双蒸馏水。

15、4.鉴定反应条件

16、分别将大肠埃希菌和泛菌基因组dna加入pcr鉴定反应体系、阳性对照反应体系和阴性对照反应体系的反应管中，置于pcr反应仪中按下列程序进行：95℃预变性5min； 95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环，72℃延伸10min，4℃保存。取 pcr产物10μl于ep管中，加入hind iii酶1μl，10×m buffer 2μl，用双蒸水补足至 20μl，37℃水浴5min，取6μl产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

17、5.结果判定

18、反应产物使用1.2％琼脂糖凝胶，在dyy-ⅲ型水平电泳仪上电泳，90v电泳50min，使用分子量100bp的dnamarker作参照，凝胶成像分析系统观察并分析得出结果。琼脂糖凝胶电泳图谱中，泛菌基因片段在425bp处，大肠埃希菌基因片段被消化成286bp和139 bp两个片段，在与阳性对照品大肠埃希菌(286bp和139bp两个片段)凝胶电泳图谱相应位置上出现dna条带，空白对照无条带，可准确区分两种细菌。

技术特征：

1.一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法，其特征是，它包含：

2.一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法，其特征是，它包含以下步骤：

技术总结
本发明涉及分子生物学技术在微生物鉴定领域的应用，是一种基于分子生物学技术快速鉴定大肠埃希菌和泛菌DNA的试剂盒。其特点是，它包含：PCR反应体系和酶切反应体系。PCR反应体系：总体系为25μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，待检DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.4μL，余为双蒸馏水。酶切反应体系：总体系20μL，取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10×M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。本发明是基于细菌16S rDNA基因片段具有高度的保守性，使用DNAMAN对大肠埃希菌和泛菌16S rDNA基因片段进行分析，发现二者具有较高的同源性，普通PCR难以鉴别。在大肠埃希菌在16S rDNA基因片段中存在一个酶切位点，而泛菌不存在此位点，据此建立PCR‑酶切技术，对大肠埃希菌进行快速、可靠的鉴定。

技术研发人员：赵云冬,王丹,赵潇颖,贾慧建,宋顺佳,姜菲菲,邵学超,赵远
受保护的技术使用者：北华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11