一种基于BmoR突变体的宽域生物传感器

：本发明属于生物工程，具体涉及一种对高级醇具有更宽检测范围(0-200mm) 的bmor突变体，及其在高级醇检测或生物传感器中的应用。

背景技术

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背景技术：

1、微生物合成的高级醇是重要的运输燃料，通过代谢工程合成的高级醇在许多微生物宿主中实现，而改造宿主菌株并筛选出高产宿主是实现高级醇工业化生产的基础和关键。生物传感器能够特异性响应目标化合物从而输出便于检测的蛋白信号，因而已经被广泛应用于高通量筛选。但野生型转录因子bmor由于其响应特异性差、检测范围窄，无法广泛应用于生物传感器及工业化生产中。而本发明通过蛋白质改造得到的bmor蛋白实现了对高级醇的更高检测浓度上限及响应强度，最重要的是可以用于筛选高级醇的高产菌株，从而满足工业需求。

2、作为新一代生物燃料，高级醇被用于诸多领域中，同时已经在多个微生物宿主中实现生物合成，但对更高产量的高级醇进行筛选仍是一件繁琐的工程。野生型转录因子bmor对底物高级醇的最高响应浓度仅为40mm，无法对更高浓度的醇分子进行检测，从而满足工业需求。因此实现对醇的更宽检测范围成为一大难题。

3、生物传感器由分子识别元件和信号转换器组成。当分子识别元件与被测物体结合时，所产生的信号可以通过转换器转换为光信号或电信号，可对被测物进行检测和分析。作为一种合成生物学新兴工具，可以通过设计构建生物传感器来动态的响应信号分子浓度的变化。与此同时，生物传感器的设计是为了促进微生物细胞工厂的优化和生产一系列广泛应用于工业的天然产品，如衣康酸、脂肪酸、异丁醇、正丁醇和生物碱。生物传感器主要包括rna核酸开关、转录因子调控的生物传感器、g蛋白偶联受体以及荧光蛋白生物传感器。而荧光蛋白生物传感器的低动态范围、rna核酸开关难以在体外进行、g蛋白偶联受体仅能在胞外进行等弊端阻碍了生物传感器在生物界的发展。

4、基于转录因子(tf)的生物传感器应用最为广泛。最常用的转录因子是细菌转录因子，包括配体结合结构域(lbd)或代谢结合结构域(mbd)和dna结合结构域(dbd)。bmor是假单胞菌正链烷烃代谢途径的转录因子，是bebp的成员，用于调节烷烃单加氧酶的σ54依赖型启动子pbmo，信号分子是c2-c5的直链或支链醇。基于bmor的生物传感器可用于筛选高产正丁醇或异丁醇菌株，但野生型bmor生物传感器的响应特异性太差、检测范围太窄(0-40mm)，无法用于工业生产中。因此对生物传感器的改造为高效检测高级醇生产和快速筛选高产菌株提供了一种解决方案。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的在于提供一种可以检测更高浓度高级醇的bmor蛋白及生物传感器，利用易错pcr技术构建随机突变文库；通过外源添加正丁醇和异丁醇，使其终浓度为0-200mm，对突变库进行筛选分析。最终得到了一种能够检测0-200mm高级醇的bmor突变体蛋白。

2、进一步地，所述能够检测0-200mm高级醇的bmor突变体蛋白，是在序列表seq idno.1 所示的野生型bmor蛋白的基础上发生t12n突变获得的，以下简称t12n突变体，所述突变体蛋白具体为：所示的氨基酸序列；或

3、(1)序列表seq id no.3所示的氨基酸序列；或

4、(2)seq id no.3同源性75％以上的氨基酸序列；或

5、(3)在seq id no.3的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有seq id no.3相同功能的氨基酸序列。

6、进一步地，本发明还提供t12n突变体的编码基因；

7、更进一步地，所述编码基因如序列表seq id no.4所示。

8、本发明的另一目的是提供t12n突变体的应用，特别是在检测含高级醇的样品，或筛选高级醇生产菌株的传感器中的应用，更特别地，是在构建检测高级醇的生物传感器中的应用；

9、进一步地，所述生物传感器是基于t12n突变体的生物传感器，所述传感器是包含t12n 突变体编码基因及其启动子、启动子pbmo及报告基因的表达元件；启动子启动bmor基因表达，bmor蛋白与醇分子结合形成六聚体，进而启动下游启动子pbmo，从而表达报告基因，产生荧光等信号；所述生物传感器能够实现在0-200mm对高级醇的响应和筛选，进一步应用于工业生产中，实现对含高级醇的样品，及实现对高级醇的高产菌株的筛选；

10、进一步地，所述突变体编码基因的启动子包括但不限于pbmor、ptac、pt7、pllaco1等；

11、进一步地，所述报告基因包括但不限于gfp、rfp、cfp、sfgfp、egfp、yfp、ecfp等基因；

12、优选地，所述表达元件为包含t12n突变体编码基因及其启动子pbmor、启动子pbmo及gfp报告基因的重组质粒；进一步地，所述重组质粒可选用的表达载体包括但不限于本领域通用的表达载体；

13、更优选地，所述生物传感器是将质粒pyh1上的野生型bmor蛋白编码基因替换为t12n 突变体编码基因所得，也即，将由pbmor启动的t12n突变体编码基因连接至cole1复制起始位点、ampr和pbmo驱动的gfp基因所得；

14、进一步地，所述菌株包括但不限于大肠杆菌，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌等；

15、进一步地，所述启动子pbmor的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；

16、进一步地，所述启动子pbmo的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示；

17、进一步地，所述gfp报告基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示。

18、本发明还提供上述生物传感器在高级醇检测中的应用，特别是异丁醇生产菌株筛选中的应用，通过将上述质粒导入生产菌株，如大肠杆菌，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌等，用以检测高级醇的产生。

19、有益效果：

20、野生型bmor的检测范围过窄，对高级醇的检测范围仅为0-40mm，在底物浓度达到40 mm时响应将达到饱和，因此无法用于鉴别高级醇浓度高于40mm的菌株。而本发明提供的t12n突变体对高级醇的检测范围达到0-200mm，提高了bmor蛋白对高级醇的响应饱和度，可用于高级醇高水平生产菌株的筛选和应用。

技术特征：

1.一种bmor突变体蛋白，其特征在于，所述突变体是在序列表seq id no.1所示的野生型bmor蛋白的基础上，发生包含t12n突变获得的。

2.如权利要求1所述的bmor突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白具体为：

3.权利要求1所述bmor突变体在检测含有高级醇的样品，或在筛选高级醇生产菌株中的应用。

4.权利要求1所述bmor突变体在构建检测高级醇的生物传感器中的应用。

5.权利要求1所述bmor突变体的编码基因。

6.如权利要求5所述的编码基因，其特征在于，如序列表seq id no.4所示。

7.包含权利要求5所述编码基因的重组质粒或重组菌株。

8.一种生物传感器，其特征在于，所述的传感器是包含权利要求5所述突变体编码基因、由bmor突变体激活的启动子pbmo、由pbmo驱动的报告基因和表达bmor突变体的启动子的表达元件。

9.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，所述报告基因包括但不限于gfp、rfp、cfp、sfgfp、egfp、yfp、ecfp基因。

10.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，表达bmor突变体的启动子包括但不限于pbmor、ptac、pt7、pllaco1。

11.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，所述传感器是将由pbmor启动的突变体编码基因连接至cole1复制起始位点、ampr和pbmo启动的gfp基因所得。

12.如权利要求8所述的生物传感器，其特征在于，启动子pbmo的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示。

13.权利要求8所述生物传感器在检测含有高级醇的环境、食品、医学、生物类样品，及筛选生产高级醇的工业微生物菌株中的应用。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种对高级醇具有更宽检测范围(0‑200mM)的BmoR蛋白突变体，及其在高级醇检测或生物传感器中的应用。所述BmoR蛋白突变体是在序列表SEQ ID NO.1所示的野生型BmoR蛋白的基础上发生T12N突变获得的，具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列T12N突变体对高级醇具有更宽检测范围(0‑200mM)，解决了野生型BmoR蛋白无法筛选高级醇高产菌株的问题，可用于更高产量菌株的筛选和应用。

技术研发人员：霍毅欣,陈振娅,毋彤
受保护的技术使用者：北京理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11