一种二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体及其应用。

背景技术：

1、丙酮酸脱氢酶多酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex，pdhc)是一组限速酶，在谷氨酸棒杆菌中，pdhc催化糖酵解过程产生的丙酮酸不可逆地氧化脱羧转化成乙酰辅酶a，将糖的有氧氧化与三羧酸循环和氧化磷酸化连接起来，是三羧酸循环的关键酶。丙酮酸脱氢酶多酶复合物由丙酮酸脱氢酶(e1p)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(e2p)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(e3p)组成。其中，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(e2p)由acef基因编码。

2、中国专利cn202110794028.7公开了一种丙酮酸脱氢酶的突变体，编码该突变体的多核苷酸，含有该突变体的宿主细胞，以及利用该突变体生产l-氨基酸的方法；中国专利cn201710650938.1公开了一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用。但二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的突变体鲜有报道。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体及其应用。

2、第一方面，本发明提供一种二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体，所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体为二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列发生如下突变中的一种或多种得到：

3、第195位由异亮氨酸突变为丝氨酸、第197位由天冬氨酸突变为谷氨酸、第200位由丙氨酸突变为谷氨酸、第207位由谷氨酸突变为谷氨酰胺、第211位由脯氨酸突变为丙氨酸。

4、进一步地，所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列包括如seq id no.1所示的序列(当全部突变发生时氨基酸序列突变为如seq id no.3所示的序列)。

5、本发明采用易错pcr随机突变方法将所述的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶基因acef进行定向进化。通过对目的基因片段进行pcr扩增，获得目的基因acef突变序列文库，并将其构建到表达载体pxmj19上，获得二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体质粒文库，将表达质粒转化谷氨酸棒杆菌mhz-0112-8中，通过比对摇瓶发酵的谷氨酸产量，挑选谷氨酸高产菌株提取出质粒，获得表达质粒pxmj19-acef9。

6、测序结果表明，acef9的核苷酸序列存在的突变位点分别为：584位由t突变为g、591位由c突变为a、599位由c突变为a、609位由t突变为a、619位由g突变为c、631位由c突变为g，对应的氨基酸序列突变位点分别为：i195s、d197e、a200e、a203a(同义突变)、e207q、p211a。与对照菌株相比，表达含有突变的基因acef9的菌株，生产谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸的能力增强。

7、本发明进一步提供编码所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体的核酸，核苷酸序列如seq id no.4所示

8、第二方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶发生如下突变中的一种或多种：

9、第195位由异亮氨酸突变为丝氨酸、第197位由天冬氨酸突变为谷氨酸、第200位由丙氨酸突变为谷氨酸、第207位由谷氨酸突变为谷氨酰胺、第211位由脯氨酸突变为丙氨酸。

10、进一步地，所述重组微生物中的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶包括如se id no.3所示的氨基酸序列。

11、进一步地，所述重组微生物中的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶由如seq id no.4所示的核苷酸序列编码得到。

12、进一步地，所述重组微生物以谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种为出发菌株。

13、本发明进一步提供所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体、或所述核酸在提高菌株氨基酸产量中的应用。

14、进一步地，所述菌株为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种；所述氨基酸为谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸或脯氨酸中的一种或多种。

15、本发明进一步提供所述重组微生物在生产氨基酸中的应用；优选地，所述氨基酸为谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸或脯氨酸中的一种或多种。

16、本发明具备如下有益效果：

17、本发明提供了一种二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体，包括多个位点的突变，将该突变体应用于菌株中时，发现在这些位点发生突变时，其谷氨酸、谷氨酰胺、和脯氨酸的产量显著提高。

18、含有该二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体的菌株mhz-0112-8/px mj19-acef9与对照mhz-0112-8/pxmj19-acef相比，谷氨酸含量从35.5g/l提高到40.7g/l，产酸提高14.65％，由此可见突变体acef9中点突变i195s、d197e、a200e、a203a(同义突变)、e207q、p211a有利于谷氨酸的生产。

19、将质粒pxmj19-acef9和pxmj19-acef分别转化谷氨酸棒杆菌mh z-0513-3，菌株mhz-0513-3/pxmj19-acef9与mhz-0513-3/pxmj19-acef相比，谷氨酰胺含量从28.5g/l提高到33.2g/l，产酸提高16.49％。

20、将质粒pxmj19-acef9和pxmj19-acef分别转化谷氨酸棒杆菌mhz-0701，菌株mhz-0701/pxmj19-acef9与mhz-0701/pxmj19-acef相比，脯氨酸产量从38.0g/l提高到41.9g/l，产酸提高10.26％。

21、因此本发明提供的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体，不仅能促进谷氨酸生产，还能促进谷氨酸衍生物谷氨酰胺、脯氨酸的生产，显而易见，可将该突变应用于其他谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等宿主菌中，用于生产谷氨酸其他衍生物，例如鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸等。

技术特征：

1.一种二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体，其特征在于，所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体为二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列发生如下突变中的一种或多种得到：

2.根据权利要求1所述的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体，其特征在于，所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列包括如seq id no.1所示的序列。

3.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1或2所述的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体。

4.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶发生如下突变中的一种或多种：

5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶包括如se id no.3所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶由如seq id no.4所示的核苷酸序列编码得到。

7.根据权利要求4-6任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物以谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种为出发菌株。

8.权利要求1或2所述的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体、或权利要求3所述核酸在提高菌株氨基酸产量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述菌株为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种；和/或，所述氨基酸为谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸或脯氨酸中的一种或多种。

10.权利要求4-7任一项所述的重组微生物在生产氨基酸中的应用；优选地，所述氨基酸为谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸或脯氨酸中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体及其应用。所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体为二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的序列中经过多种突变得到。本发明提供了二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的多个突变位点，并进一步发现菌株中二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的这些位点经过突变后，其生产谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸等氨基酸的产量显著提高，这在提高菌株生产谷氨酸及其衍生物的领域具有重要意义。

技术研发人员：吴涛,栾明月,张晓云,薛婷莉,李鑫磊,赵津津,李岩
受保护的技术使用者：冯波
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15