一种用于肠道病毒EV71型和CoxA16型的快速荧光PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种同时检测肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的双重荧光pcr检测试剂盒，本发明提供用于肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型检测的特异性引物和探针，并建立了肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的双重荧光pcr检测方法。本发明的特异性引物探针和检测方法特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好，为肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的检测、鉴别与诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法，属于体外诊断领域。

背景技术：

1、手足口病属于肠道传染性疾病，常见的肠道感染病毒有 20余种，以肠道病毒ev71 型和 coxa16 型较常见。流行病数据调查显示，近年来手足口病患病率居高不下中国手足口病发病率呈隔年暴发流行表现。手足口病在各个季节均可发病，其中，5～9 月的夏秋季较为常见，春冬季发病呈逐年减少趋势。手足口病多发且集中在年龄＜5岁患儿，有口腔、 手、足疱疹及溃疡等表现，部分患儿合并低热、口痛等症状。多数患儿经对症支持治疗后，预后良好，但仍有患儿会发生心肌炎、肺水肿等并发症，重者会导致死亡。早期诊断对挽救重症患儿的生命极其重要。要降低重症手足口病病死率，关键在于要开发出一种能快速、准确诊断患儿是否感染肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的检测试剂盒。本试剂盒包括肠道病毒 coxa16 型和 ev71 型双重检测体系，主要用于肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的快速检测和鉴定。

2、目前，以实时荧光定量pcr技术为基础的核酸诊断方法是国内应用最为广泛的方法之一，该方法的原理主要基于标记不同颜色taq-man荧光探针。现有的核酸检测试剂盒大多采用单重探针方法实现靶基因的快速诊断。本发明采用双重荧光定量pcr技术，在同一反应体系中加入2条不同颜色标记的荧光探针，可以实现在一管反应中同时检测2个靶基因的目的，能够同时检测肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型，通量高，检测速度快。在手足口病诊断和防治等方面具有重要的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种同时检测肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的双重荧光pcr检测试剂盒及使用方法，快速准确地检测样品中是否存在肠道病毒 ev71 型和coxa16 型，提供一种特异性检测肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的双重荧光pcr试剂盒。

2、组分包括pcr反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中pcr反应液主要含有上述的2种病毒的引物和探针、反应缓冲液、mg2+和dntp等，酶混合液主要含有逆转录酶和热启动taq酶，阴性质控品为无rnase和dnase水，阳性质控品为含有肠道病毒 ev71 型和coxa16 型检测靶序列的重组质粒。

3、pcr反应液中用于核酸扩增的引物为p1和p2，p1和p2为针对肠道病毒 ev71 型和coxa16 型基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；pcr反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为probe1，probe1为针对肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针具体引物序列（见表1）。

4、表1 引物和探针序列

5、

6、试剂盒选用的pcr反应体系为20 µl，包括2×pcr缓冲液10 µl、10mmol/l dntp1.0 µl、热启动taq酶混合液0.8µl、混合引物0.35µl、样品rna 2µl，加灭菌水至终体系20 µl。

7、试剂盒的pcr反应循环，逆转录阶段：42℃，10min；预变性阶段：94℃，10sec；预扩增阶段：变性 94℃，5sec；退火 50℃，20sec；延伸 72℃，20sec；共5个循环。注意本阶段不采集荧光信号。检测阶段：变性 94℃，5sec；退火 56℃，50sec；延伸 72℃，15sec；共40个循环。在退火步骤检测荧光信号。

8、质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无ct值（或ct值为0），阳性对照ct值≤30，否则实验结果不成立。

9、结果判读：

10、阳性：出现“s”型扩增曲线，ct值≤35；可疑：出现“s”型扩增曲线，但ct值＞35；阴性：没有出现“s”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“s”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“s”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。

11、样本要求：临床样本类型包括粪便标本、疱疹液、咽拭子、痰液和病毒培养物；临床样本采集后应带冰运输，-20℃保存，不能反复冻融；从临床样本提取rna，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的rna应立即检测，否则，应将rna分装后-80℃～-20℃保存。

12、本发明提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出肠道病毒 ev71 型和 coxa16型，但不能检出非 ev71 型、coxa16 型病原体的核酸；对肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需要2小时即可完成检测，可为手足口病的监测和临床诊断提供实验依据。

技术特征：

1.一种同时检测他肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的引物探针组合，其特征在于，包括肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的检测引物探针，具体引物探针序列如下：

2.一种同时检测他肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型的双重荧光pcr检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物探针混合物对肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型同时进行检测；肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型上游引物、下游引物和探针mix的配比， ev71 型引物探针mix，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .032～0.128：0 .032～0.128：0 .012～0.08；coxa16 型引物探针mix，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .032～0.128：0.032～0.128：0 .012～0.08；0 .012～0.08。

3.根据权利要求2所述的双重荧光pcr检测方法，其特征在于，肠道病毒 ev71 型和coxa16 型上游引物、下游引物和探针配比， ev71 型引物探针mix，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .008～0.112：0 .008～0.112：0 .04～0.10；coxa16 型引物探针mix，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .08～0.112：0 .048～0.128：0 .04～0.08。

4.根据权利要求2所述的双重荧光pcr检测方法，其特征在于，所述双重荧光pcr的反应体系为：2×pcr缓冲液10 µl、10mmol/l dntp 1.0 µl、热启动taq酶混合液0.4 µl、混合引物探针0.5µl、样品dna 2µl，加灭菌水至终体系20 µl。

5.根据权利要求2所述的双重荧光pcr检测方法，其特征在于，所述双重荧光pcr的扩增程序为：42℃，10min；预变性阶段：94℃，10sec；预扩增阶段：变性 94℃，5sec；退火 50℃，20sec；延伸 72℃，20sec；共5个循环；注意本阶段不采集荧光信号；检测阶段：变性 94℃，5sec；退火 56℃，50sec；延伸 72℃，15sec；共40个循环；在退火步骤检测荧光信号。

6.权利要求1所述的引物探针混合物在制备用于肠道病毒 ev71 型和 coxa16 型检测的试剂盒中的用途。

7.根据权利要求6和3所述，其特征在于，所述试剂盒中，引物探针混合物中肠道病毒ev71 型和 coxa16 型引物探针mix的配比， ev71 型引物探针mix：coxa16 型引物探针mix＝0 .05～0.25：0 .05～0.25。

8.根据权利要求7所述，其特征在于，所述试剂盒中，引物探针混合物中肠道病毒 ev71型和 coxa16 型引物探针mix的配比，ev71 型引物探针mix：coxa16 型引物探针mix＝0 .1～0.25：0 .10～0.25。

技术总结
本发明公开了一种同时检测肠道病毒EV71型和CoxA16型的双重荧光PCR方法及其用途。本发明提供用于肠道病毒EV71型和CoxA16型检测的特异性引物和探针，并建立了肠道病毒EV71型和CoxA16型的双重荧光PCR检测方法。本发明的特异性引物探针和检测方法特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好，为肠道病毒EV71型和CoxA16型的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

技术研发人员：丁小静
受保护的技术使用者：江苏和创生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12