一种基于SSR区分野生羊鲍群体和底播群体的分子标记技术

本发明属于羊鲍种的分子标记，具体涉及羊鲍的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、羊鲍（ haliotis ovina）为雌雄异体, 其贝壳呈卵圆形, 一般壳长70mm左右, 螺层约4层, 螺旋部较宽大。壳面粗糙不平, 为灰绿色或褐色, 布有黄 白色花纹; 壳内为银白色。羊鲍栖息岩石质的海底, 在低潮线附近的岩石下面或岩石缝内即可采到。羊鲍在我国主要分布于西沙群岛海域和海南岛等南部沿海, 在国外主要分布于澳大利亚、马来西亚、菲律宾、日本等海域。

3、羊鲍不仅是重要的海珍品，而且在我国南海岛礁瑚礁生态系有重要生态功能，我国目前野生海洋生物资源量急剧减少，如何进行羊鲍生态增养殖和资源养护成为研究的热点。建立成熟、快速的野生羊鲍群体和底播群体分子生物学鉴定技术体系，成为羊鲍生态增养殖和资源养护的有力手段。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种区分野生羊鲍群体（三沙市海区）和底播群体（源自万宁和三亚的亲本产生的后代）的ssr标记指纹图谱及其构建方法与应用，本发明开发的野生羊鲍群体和底播羊鲍群体的ssr分子标记重复性好、共显性、多态性高和特异性强。

2、本发明目的是提供一种区分野生羊鲍群体和底播群体的分子标记及其应用：

3、具体的，在本发明的第一方面，提供一组野生羊鲍群体和羊鲍底播群体ssr分子标记，其特征在于：包括有如下4个位点所对应的正向和反向引物：

4、

5、具体的，在本发明的第二方面，本发明提供一种针对羊鲍的ssr标记指纹图谱的构建方法，包括：

6、(1)基因组dna的提取：利用海洋动物组织dna提取试剂盒，按照试剂盒实验步骤提取基因组dna，并取5μldna进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。紫外分光光度法检测总基因组dna浓度和纯度，调整样品dna的浓度一致；

7、(2)ssr分子标记引物开发：根据羊鲍的线粒体基因组重测序结果，选取多态性序列设计ssr引物并合成；

8、(3)ssr分子标记的检测：对上述提取的dna进行基因ssr标记的pcr扩增；

9、(4)电泳检测：将上述pcr扩增得到的产物与甲酰胺加样缓冲液混匀，变性，上机检测；

10、羊鲍群体和羊鲍底播群体ssr的验证及多态性分析。

11、(5) 羊鲍群体和羊鲍底播群体ssr的验证及多态性分析。

12、所述的针对羊鲍的ssr标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)基因组dna的提取，其具体方法包括：

13、(1)将30mg羊鲍腹足肌肉组织加入液氮充分研磨；

14、(2)向研磨好的粉末中迅速加入有200μlga缓冲液，迅速涡旋混匀后，加入4μlrnasesolution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置5-10min

15、(3)加入20μlproteinasek(20mg/ml)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将离心管放在56℃水浴45min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次直至组织完全溶解；

16、(4)加入200μlbuffergb，颠倒离心管以混合样本数次，70℃放置10min；

17、(5)加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀简短离心以去除管盖内壁的水珠；

18、(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀的一半加入一个dna结合柱中（dna结合柱放入收集管中）12000g离心30sec；

19、(7)倒掉废液，将dna结合柱放回收集管中，转移剩余混合液至柱子中，12000g离心30sec；

20、(8)倒弃滤液把柱子装回收集管，向吸附柱中加入500μlbuffergd，12000g离心30sec；

21、(9)倒弃滤液把柱子装回收集管，向吸附柱中加入600μlbufferpw，12000g离心30sec；

22、(10)重复步骤9；

23、(11)倒弃滤液把柱子装回收集管，12000g离心2min3置于室温放置数分钟，去除柱子中残留的乙醇；

24、(12)将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入200μl的bufferte至柱子的膜中央，室温静置5min，12000g离心2min；

25、(13)取5μldna用于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μldna用于nanodrop分光光度计测浓度，剩余dna保存于-20℃低温冰箱。

26、所述步骤(3)中的pcr扩增体系为：总体积50μl，包括：10×pcrbuffer5μl，2.5mmol/ldntp4μl，5u/μltakaraextaq酶0.25μl，5μmol/ltp-yb.2μl,5μmol/lssr标记特异引物各2μl，浓度20ng～30ng/μl提取的模板dna2μl，ddh2o34.75μl；

27、pcr反应条件：95℃3min；95℃10s，58℃30s，72℃30s，30个循环；95℃3min；95℃10s，53℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min。

28、所述步骤(5)中的变性的具体工艺为于95℃变性3min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。

29、所述步骤(5)中的电泳的工艺参数为：变性聚丙烯酰胺凝胶为商用pop7胶，电泳缓冲液为3730bufferedta，注入电压2000v，运行电压15000v，进样时间10s，温度60℃，毛细管长度50cm，功率200w，电泳20min，电流和功率均为动态。

30、本发明的有益效果：

31、本发明开发的ssr引物在野生羊鲍群体和底播羊鲍群体基因组中的扩增产物有明显的条带大小或条带数目的差异，可用于这两个羊鲍品种的鉴定等方面。

32、本发明开发的野生羊鲍群体和底播羊鲍群体的ssr分子标记重复性好、共显性、多态性高和特异性强，且具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需的操作时间在24h以内(包括提取基因组dna、pcr扩增、电泳分析、数据分析)，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，本发明方法在所采集捕获的37个羊鲍个体中具有地域特异性，具有良好的应用前景。

33、

技术特征：

1.野生羊鲍群体和底播羊鲍群体ssr分子标记，其特征在于：包括有如下4个位点所对应的正向和反向引物：

2.权利要求1所述野生羊鲍群体和底播羊鲍群体ssr分子标记在以下任一方面的应用：1)野生羊鲍群体和底播羊鲍群体的多态性鉴定；

3.权利要求1所述野生羊鲍群体和羊鲍底播羊鲍群体ssr分子标记的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中，从网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/mt185927.1/下载羊鲍线粒体基因组序列。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，用ssr鉴定软件misa(microsatellite，https://webblast.ipkgatersleben.de/misa/)查找ssr位点，然后分析每个ssr位点的位置，查找所有位于基因序列中间的ssr位点。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，分别下载ssr的侧翼序列，然后用primerpremier5.0软件在ssr序列两端的序列保守区设计引物；设计好的引物在基因组序列上分析可能结合位点。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)中，以野生羊鲍群体和底播羊鲍群体的新鲜腹足组织为材料，用ctab法提取其基因组dna；利用设计合成的引物对野生羊鲍群体和底播羊鲍群体的基因组进行pcr扩增，pcr结果用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经银染后对page胶图拍照，分析这两个羊鲍品种的pcr产物的异同，分析找出在这两个品种间pcr结果有差异的ssr分子标记。

技术总结
本发明涉分子标记技术领域，具体涉及野生羊鲍群体和底播羊鲍群体的SSR分子标记及其应用。野生羊鲍群体和底播羊鲍群体SSR分子标记包括3个位点所对应的正向和反向引物，其开发方法包括以下步骤：1)测序获取羊鲍线粒体基因组序列，2)用SSR鉴定软件MISA查找所有位于基因序列中间的SSR位点，3)设计SSR引物，4)SSR的验证及多态性分析，利用设计合成的引物对野生羊鲍群体和底播羊鲍群体的基因组进行PCR扩增，分析这两个羊鲍品种的PCR产物的异同，分析找出在这两个品种间PCR结果有差异的SSR分子标记。本发明开发的野生羊鲍群体和底播羊鲍群体的SSR分子标记重复性好、共显性、多态性高和特异性强。

技术研发人员：黄勃,浦舒为,赵辰,穆虹伶,文娇,杨鸿宇,王公嗣,程遂,王小兵,王颖
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12