一种用于筛选抗氧化活性高的黄绿卷毛菇的DNA条形码的制作方法

一种用于筛选抗氧化活性高的黄绿卷毛菇的dna条形码
技术领域
1.本发明涉及食用菌种质资源筛选技术领域，更具体的说是涉及一种用于筛选抗氧化活性高的黄绿卷毛菇的dna条形码。


背景技术：

2.黄绿卷毛菇，色泽呈金黄色，又称为黄蘑菇、金蘑菇。黄绿卷毛菇主要分布于青藏高原，主产区为西藏自治区当雄县、青海省祁连县以及四川省石渠县等，也以这三个主产区的品质最佳。黄绿卷毛菇是一种风味独特的优质食用菌，当前不能人工栽培。评价黄绿卷毛菇营养价值风味及生物学活性的主要指标包括：总可溶性蛋白、总可溶性氨基酸、总多酚、总多糖和总脂肪含量高，抗氧化活性强。按传统方法，要筛选出优质菌株十分困难，此外，由于其所分布的主产区海拔较高，样本采集也十分困难。为了实现黄绿卷毛菇的开发利用，利用dna条形码分子鉴定技术辅助筛选优质黄绿卷毛菇菌株显得尤为重要和迫切。黄绿卷毛菇不同产地具有不同营养价值，不同风味，不同生物学活性，不同市场价格。以往对黄绿卷毛菇的选育主要利用形态学方法结合上述有益指标测定进行。
3.但是受到特殊的青藏高气候原环境的影响不同地区所产的黄绿卷毛菇常常出现同名异物和同物异名的现象，因此形态学鉴别法难以有效区分。更为困难的是，不能通过形态学方法来筛选出总可溶性蛋白、总可溶性氨基酸、总多酚、总多糖和总脂肪含量高，抗氧化活性强的优质菌株。dna条形码分子鉴定技术是基于dna条形码(基因组中保守且稳定遗传dna序列)来进行物种和优良品质识别鉴定的分子生物学技术。它是传统育种方法的有效补充和拓展，能够在样品形态不完整或缺乏形态结构(加工制品如粉末等)时对样品进行精准和有效地鉴定。
4.现有的dna条形码技术中，its(核糖体rna内转录间隔区)和线粒体体中的非编码区或保守基因序列主要用于物种物鉴定；限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，rflp)操作十分繁复，结果的可靠性和可重复性较差，随机扩增多态性dna(random amplified polymorphic dna，rapd)易受干扰，对操作者技术水平要求较高，在辅助育种工作中难以推广；单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)对设备要求高，成本也高。
5.因此针对传统育种方法选育黄绿卷毛菇菌株不够准确费时费力的缺点，如何提供一种可以准确、快捷鉴别黄绿卷毛菇的所属菌株，同时实现优质品质选育的dna条形码，具有成本低，效率高，操作简便，结果稳定可靠性重复性好的特点是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种用于筛选抗氧化活性高的黄绿卷毛菇的dna条形码。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种筛选黄绿卷毛菇抗氧化活性指标的dna条形码，dna条形码的核苷酸序列包
括：
9.如seq id no：3；
10.和/或seq id no：4；
11.和/或seq id no：3和seq id no：4组合；
12.和/或seq id no：9；
13.和/或seq id no：7和seq id no：8组合；
14.和/或seq id no：7和seq id no：9组合；
15.和/或seq id no：12；
16.和/或seq id no：13；
17.和/或seq id no：14；
18.和/或seq id no：13和seq id no：14组合；
19.和/或seq id no：17；
20.和/或seq id no：18；
21.和/或seq id no：17和seq id no：18组合；
22.和/或seq id no：19和seq id no：20组合；
23.和/或seq id no：17、seq id no：18和seq id no：19和seq id no：20组合中的一种或多种。
24.本发明基于黄绿卷毛菇全基因组中所有简单重复序列(simple sequence repeat，ssr)进行荧光pcr扩增，确立了与抗氧化活性有效对应的dna条形码，扩增所得片段与本发明的dna条形码进行比对，可以快速、准确地筛选出黄绿卷毛菇抗氧化活性高的菌株，为黄绿卷毛菇的育种提供有利辅助。
25.本发明的又一目的是，提供可扩增上述筛选黄绿卷毛菇抗氧化活性指标的dna条形码的引物组，引物组的核苷酸序列包括：
26.如seq id no：1和seq id no：2，
27.和/或seq id no：5和seq id no：6，
28.和/或seq id no：10和seq id no：11，
29.和/或seq id no：15和seq id no：16中的一组或多组。
30.作为本发明优选的技术方案，引物组的核苷酸序列包括：如seq id no：1和seq id no：2、seq id no：5和seq id no：6、seq id no：10和seq id no：11、seq id no：15和seq id no：16。
31.本发明不同的引物组可以单独或组合使用筛选黄绿卷毛菇的抗氧化活性，当所有引物组共同使用时，筛选的准确率最高。
32.本发明的再一目的是，提供一种以抗氧化活性指标筛选黄绿卷毛菇的方法，包括如下步骤：
33.s1、提取待测样品基因组dna；
34.s2、以s1基因组dna为模板，上述的一组或多组引物分别进行荧光pcr扩增反应，得扩增产物；
35.s3、s2所述扩增产物经毛细管荧光电泳检测，通过扩增产物的片段数、ssr位点数、ssr重复元件及其重复次数进行判定。
36.作为本发明优选的技术方案，所述步骤s3的判定标准为：
37.seq id no：1和seq id no：2引物组扩增得到含13次gag重复元件的256bp片段和含19次gag重复元件的274bp片段；
38.和/或seq id no：5和seq id no：6引物组扩增得到含5次cag重复元件的257bp片段和含8次cag重复元件的266bp片段；
39.和/或seq id no：10和seq id no：11引物组扩增得到含19次at重复元件的254bp片段和含20次at重复元件的256bp片段；
40.和/或seq id no：15和seq id no：16引物组扩增得到含10次gct重复元件的282bp片段和含11次gct重复元件的285bp片段时，判定该黄绿卷毛菇为抗氧化活性高的黄绿卷毛菇。
41.作为本发明优选的技术方案，步骤s2荧光pcr扩增反应的反应体系为：
[0042]2×
taq pcrmastermix 5μl，基因组dna 1μl，上游引物0.1μl，下游引物0.4μl，带荧光的m13引物0.4μl，用无菌去离子水定容至10μl。
[0043]
更优选的，上游引物、下游引物和带荧光的m13引物浓度均为10um。
[0044]
作为本发明优选的技术方案，步骤s2荧光pcr扩增反应程序为：
[0045]
95℃预变性3min；95℃变性30s，62至55℃降落pcr退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃终延伸20min；4℃保温6h后用于荧光毛细管电泳检测。
[0046]
本发明的再一目的是，提供上述dna条形码和/或上述引物组在制备以抗氧化活性指标筛选黄绿卷毛菇的产品中的应用。
[0047]
本发明的再一目的是，提供一种以抗氧化活性指标筛选优质黄绿卷毛菇的产品，含有上述的一组或多组引物组，且符合标准：
[0048]
seq id no：1和seq id no：2引物组扩增得到含13次gag重复元件的256bp片段和含19次gag重复元件的274bp片段；
[0049]
和/或seq id no：5和seq id no：6引物组扩增得到含5次cag重复元件的257bp片段和含8次cag重复元件的266bp片段；
[0050]
和/或seq id no：10和seq id no：11引物组扩增得到含19次at重复元件的254bp片段和含20次at重复元件的256bp片段；
[0051]
和/或seq id no：15和seq id no：16引物组扩增得到含10次gct重复元件的282bp片段和含11次gct重复元件的285bp片段中的一个或多个。
[0052]
作为本发明优选的技术方案，产品为试剂盒。
[0053]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于筛选抗氧化活性高的黄绿卷毛菇的dna条形码，相较于现有技术本发明可以准确、快捷鉴别黄绿卷毛菇菌株，同时实现优质品质选育的dna条形码技术，具有成本低，效率高，操作简便，结果稳定可靠性重复性好的特点。
[0054]
本发明与传统育种方法及其他现有dna条形码技术相比较，它具有省时、省力、省钱、准确、高效的优点，在优质黄绿卷毛菇原产地鉴别和遗传育种上发挥积极作用，同时也为种质资源的鉴定及保护提供了一种有效方法。
附图说明
[0055]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0056]
图1附图为本发明实施例、对比例1和2的抗氧化活性含量对比结果图，其中由左至右依次为对比例1、对比例2和实施例。
[0057]
图2附图为本发明利用引物1pcr扩增对比例1、2和实施例对比结果图。
[0058]
图3附图为本发明利用引物2pcr扩增对比例1、2和实施例对比结果图。
[0059]
图4附图为本发明利用引物3pcr扩增对比例1、2和实施例对比结果图。
[0060]
图5附图为本发明利用引物4pcr扩增对比例1、2和实施例对比结果图。
具体实施方式
[0061]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0062]
本发明实施例公开了一种用于筛选抗氧化活性高的黄绿卷毛菇的dna条形码。
[0063]
实施例1
[0064]
黄绿卷毛菇dna条形码的构建
[0065]
采集西藏自治区当雄县、青海省祁连县、四川省石渠县的黄绿卷毛菇样品进行基因组测序，使用misa程序对基因组序列中的ssr位点进行分析。
[0066]
设计引物对这些ssr位点进行pcr扩增，保留能扩增出对应片段的引物，舍弃无效引物。
[0067]
选取西藏自治区当雄县、青海省祁连县、四川省石渠县的黄绿卷毛菇样品测定抗氧化活性。
[0068]
利用有效引物对上述三个产地样品分别扩增并通过毛细管电泳检测。经分析建立抗氧化活性对应的简单重复序列(simple sequence repeat，ssr)位点。最终获得4对引物(见表1)，利用这4对引物对样品基因组进行扩增所得片段多态性可辅助筛选抗氧化活性好的黄绿卷毛菇菌株。
[0069]
表1黄绿卷毛菇抗氧化活性好的菌株筛选特异引物
[0070][0071]
实施例2
[0072]
黄绿卷毛菇高抗氧化活性菌株ssr特异引物扩增
[0073]
(1)抗氧化活性测定
[0074]
以西藏自治区当雄县样品为本发明试验例，将子实体样品冻干粉碎过50目筛，以1克干粉加20ml双蒸水，用300w超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成水提取液。
[0075]
对比例1：青海省祁连县样品(处理方法同上)。
[0076]
对比例2：四川省石渠县样品(处理方法同上)。
[0077]
提取物抗氧化活性测定用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼乙醇溶液测定。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，dpph)常用于测定食品的总抗氧化活性，用清除百分比表示。测定方法如田平平等(中国农业科学,2016,49(3):543-553)，以清除dpph自由基百分率表示。
[0078]
其中青海省祁连县样品dpph自由基清除率为81.3％(
±
0.59％)，四川省石渠县样品dpph自由基清除率为71.53％(
±
0.95％)，西藏自治区当雄县样品dpph自由基清除率为91.18％(
±
0.39％)，青海省祁连县样品确定为对比例1，四川省石渠县样品确定为对比例2，西藏自治区当雄县样品确定为试验例(参见附图1)。
[0079]
(2)利用生工生物工程(上海)有限公司ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒(货号b518259)提取黄绿卷毛菇样品基因组，稀释至20ng/μl用于荧光pcr扩增。
[0080]
(3)利用表1中引物进行荧光pcr扩增ssr dna条形码。
[0081]
荧光pcr扩增反应体系(10μl)：2
×
taq pcr mastermix 5μl，模板(基因组dna)1μl，上游引物0.1μl，下游引物0.4μl(上下游引物浓度均为10um)，带荧光的m13引物(浓度10um)0.4μl，用无菌的去离子水定容至10μl；
[0082]
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，62至55℃降落pcr退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃终延伸20min；4℃保温6h后用于荧光毛细管电泳检测。
[0083]
(4)将pcr产物进行定量稀释后，取1μl pcr稀释产物加9μl甲酰胺(含1％内标)变性后上dna测序仪abi 3730xl进行毛细管荧光电泳检测。内标为liz-500分子量内标(又称分子量内对照，internal lane standards)由16条带有liz荧光素(橙色)标记的双链dna片段组成，分子量分别是：35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490和500bp。扩增结果电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上m13荧光引物(约18bp)，误差范围1-2bp，扩增毛细管电泳峰结合测序结果，峰数量表示该基因杂合子扩增片段数量。
[0084]
(5)采用以上方法对试验例、对比例1和对比例2的黄绿卷毛菇进行鉴定。
[0085]
引物1扩增结果如附图2所示，当使用引物1进行荧光pcr扩增时，扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个ssr位点，ssr重复元件为gag。其中试验例所得扩增片段的特征信息为扩增片段为含13次重复gag的256bp片段和含19次重复gag的274片段。
[0086]
引物1扩增片段：(其中电泳图统计片段长度包括m13荧光引物，具体序列展示去掉了该m13荧光引物序列(19bp)，误差为1bp，下划线部分为ssr重复元件。)
[0087]
256bp扩增片段序列：
[0088]
tgtcgctgaagtgaaaggctctgtgagtagatgtgagccgacagagagatataccgcatactttagttgtgtatgagtggaaccaaatagctgcctctgatgaagtgttttgagtcgtttagatggtatgggtgagggtgatgatgaagaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggatgagacggatgacgaagaatcagaatcagagtccgaagtgttagactcgtccgaagtgtcaggtgaa，如seq id no.3；
[0089]
274bp扩增片段序列：
[0090]
tgtcgctgaagtgaaaggctctgtgagtagatgtgagccgacagagagatataccgcatactttagttgtgtatgagtggaaccaaatagctgcctctgatgaagtgttttgagtcgtttagatggtatgggtgagggtgatgatgaagaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggaggatgagacggatgacgaagaatcagaatcagagtccgaagtgttagactcgtccgaagtgtcaggtgaa，如seq id no.4；
[0091]
引物2扩增结果如附图3所示，当使用引物2进行荧光pcr扩增时，扩增得到3个片段(3个峰)，含有3个ssr位点，ssr重复元件为cag。其中试验例所得扩增片段的特征信息为分别5和8次重复cag的257bp和266bp片段。
[0092]
引物2扩增片段：(其中电泳图统计片段长度包括m13荧光引物，具体序列展示去掉了该m13荧光引物序列(18bp)，263bp的扩增片段电泳图统计片段包括m13荧光引物序列(17bp)，误差为1bp，下划线部分为ssr重复元件。)
[0093]
257bp扩增片段序列：
[0094]
agcgatgcaacaacaacgtcaacatgagcagcaacagcaacaacagcaacaacagcaacagcaacaggcacaacaaggtcaaatgcatcgtacagtaggtcctagtggtattgcaattggtaatgcacagttagcggctatgcaacaacatcagcagcagcaacagcagcaacatcaacaccaacagcagcagcagcagcaacaccaacagcatctctcgcagcaacaaggaatgggcggaatgggaatgggtggaa，如seq id no.7；
[0095]
263bp扩增片段序列：
[0096]
agcgatgcaacaacaacgtcaacatgagcagcaacagcaacaacagcaacaacagcaacagcaacaggcacaacaaggtcaaatgcatcgtacagtaggtcctagtggtattgcaattggtaatgcacagttagcggctatgcaacaacatcagcagcagcaacagcagcaacatcaacaccaacagcagcagcagcagcagcagcaacaccaacagcatctctcgcagcaacaaggaatgggcggaatgggaatgggtggaa，如seq id no.8；
[0097]
266bp扩增片段序列：
[0098]
agcgatgcaacaacaacgtcaacatgagcagcaacagcaacaacagcaacaacagcaacagcaacaggcacaacaaggtcaaatgcatcgtacagtaggtcctagtggtattgcaattggtaatgcacagttagcggctatgcaacaacatcagcagcagcaacagcagcaacatcaacaccaacagcagcagcagcagcagcagcagcaacaccaacagcatctctcgcagcaacaaggaatgggcggaatgggaatgggtggaa，如seq id no.9；
[0099]
引物3扩增结果如附图4所示，当使用引物3进行荧光pcr扩增时，扩增得到3个片段(3个峰)，含有3个ssr位点，ssr重复元件为at。其中试验例所得扩增片段的特征信息为分别19和20次重复at的254bp和256bp片段。
[0100]
引物3扩增片段：(其中电泳图统计片段长度包括m13荧光引物，具体序列展示去掉了该m13荧光引物序列(18bp)，下划线部分为ssr重复元件。)
[0101]
236bp扩增片段序列：
[0102]
aaccgtttgtccttgccgtacttccgagtctacttcgtgcaaatgcctcgaatgactttcatttaatatatatatatatatatatcccgagaaaatataaaactgcaagcattggcttgcatccagtcggctgttcatggtacatacaaattgatttatatagattggccagtcaatgtgtctaatattgaaaacccggaaaaattccacaatgtaaagaaacgatccaggcgtcc，如seq id no.12；
[0103]
254bp扩增片段序列：
[0104]
aaccgtttgtccttgccgtacttccgagtctacttcgtgcaaatgcctcgaatgactttcatttaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatcccgagaaaatataaaactgcaagcattggcttgcatccagtcggctgttcatggtacatacaaattgatttatatagattggccagtcaatgtgtctaatattgaaaacccggaaaaattccacaatgtaaagaaacgatccaggcgtcc，如seq id no.13；
[0105]
256bp扩增片段序列：
[0106]
aaccgtttgtccttgccgtacttccgagtctacttcgtgcaaatgcctcgaatgactttcatttaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatcccgagaaaatataaaactgcaagcattggcttgcatccagtcggctgttcatggtacatacaaattgatttatatagattggccagtcaatgtgtctaatattgaaaacccggaaaaattccacaatgtaaagaaacgatccaggcgtcc，如seq id no.14；
[0107]
引物4扩增结果如附图5所示，当使用引物4进行荧光pcr扩增时，扩增得到4个片段(4个峰)，含有4个ssr位点，ssr重复元件为atg。其中试验例所得扩增片段的特征信息为分别含10和11次重复gct的282bp片段和285bp片段。
[0108]
引物4扩增片段：(其中电泳图统计片段长度包括m13荧光引物，具体序列展示去掉了该m13荧光引物序列(18bp),下划线部分为ssr重复元件。)
[0109]
276bp扩增片段序列：
[0110]
gtctgcagacttccggaacagttggagggcttcaagttcatccttgctgagatagtcctttgtgttgagctggacagcatactggaggatagagtctgggagaagagagttgtctggaggagggtttggctgagagaatttgttgagcaggcatgatgatgatgatgatgatgatgaggaaaggatggggacagagagagattttatatattggaataaaacatattattatatcaaagatctagattctagacttggctagacctttcgtgcgat，如seq id no.17；
[0111]
279bp扩增片段序列：
[0112]
gtctgcagacttccggaacagttggagggcttcaagttcatccttgctgagatagtcctttgtgttgagctggacagcatactggaggatagagtctgggagaagagagttgtctggaggagggtttggctgagagaatttgttgagcaggcatgatgatgatgatgatgatgatgatgaggaaaggatggggacagagagagattttatatattggaat
aaaacatattattatatcaagaatctagattctagacttggctagacctttcgtgcgat，如seq id no.18；
[0113]
282bp扩增片段序列：
[0114]
gtctgcagacttccggaacagttggagggcttcaagttcatccttgctgagatagtcctttgtgttgagctggacagcatactggaggatagagtctgggagaagagagttgtctggaggagggtttggctgagagaatttgttgagcaggcatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgaggaaaggatggggacagagagagattttatatattggaataaaacatattattataatcaagatctagattctagacttggctagacctttcgtgcgat，如seq id no.19；
[0115]
285bp扩增片段序列：
[0116]
gtctgcagacttccggaacagttggagggcttcaagttcatccttgctgagatagtcctttgtgttgagctggacagcatactggaggatagagtctgggagaagagagttgtctggaggagggtttggctgagagaatttgttgagcaggcatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgaggaaaggatggggacagagagagattttatatatttggaataaaacatattattatatcaagatctagattctagacttggctagacctttcgtgcgat，如seq id no.20；
[0117]
通过对试验例、对比例1和对比例2图谱和测序结果综合分析，获得抗氧化活性好的黄绿卷毛菇的dna条形码特征信息如表2。
[0118]
表2抗氧化活性高的黄绿卷毛菇的dna条形码特征
[0119][0120][0121]
引物1扩增出含13次gag重复元件的256bp片段(如seq id no：3所示)和含19次gag重复元件的274bp片段(如seq id no：4所示)，引物2扩增出含5次cag重复元件的257bp片段(如seq id no：7所示)和含8次cag重复元件的266bp片段(如seq id no：9所示)；引物3扩增出含19次at重复元件的254bp片段(如seq id no：13所示))和含20次at重复元件的256bp片段(如seq id no：14所示)；引物4扩增出含10次gct重复元件的282bp片段(如seq id no：19所示)和含11次gct重复元件的285bp片段(如seq id no：20所示)。当同时分别使用上述引物1、2、3、4进行综合检测判断时，黄绿卷毛菇抗氧化活性指标筛选的准确性最好。
[0122]
实施例3
[0123]
黄绿卷毛菇抗氧化活性指标筛选验证
[0124]
通过盲试试验验证黄绿卷毛菇抗氧化活性的dna条形码。
[0125]
第一步盲试，以抗氧化活性dpph自由基清除率高于或等于91.1％的西藏自治区当
雄县样品为试验例，以低于91.1％(显著性p《0.05)的青海省祁连县和四川省石渠县样品为对比1组和对比2组，各取16份样品进行盲试；
[0126]
第二步测试，利用引物(seq id no：1和seq id no：2，seq id no：5和seq id no：6，seq id no：10和seq id no：11，seq id no：15和seq id no：16)扩增并进行毛细管电泳。引物组可使用一对或多对组合扩增以试验例dna条形码特征区分盲试样品；
[0127]
第三步揭盲，结果如表3所示，以抗氧化活性条形码特征区分抗氧化活性共48份样品揭盲结果全部正确。由此说明抗氧化活性的dna条形码适用于抗氧化活性性状的筛选。
[0128]
表3抗氧化活性dna条形码特征揭盲鉴定结果
[0129][0130][0131]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0132]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的
一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。