一种用HaCaT细胞构建的皮肤细胞紫外线损伤模型的制作方法

本发明属于细胞模型，具体涉及一种用hacat细胞构建的紫外线损伤皮肤细胞模型；即一种以永生化角质形成细胞hacat作为细胞来源构建的皮肤细胞模型，可应用于皮肤紫外线光照损伤研究领域。

背景技术：

0、技术背景

1、皮肤作为人体最大的器官，其直接与外环境接触，是人体抵御外界伤害的第一道防线。在众多皮肤损伤因素中，紫外线是最常见的一种。紫外线按波长不同可分为长波(uva)、中波(uvb)和短波(uvc)三种。其中uva波长为320-400纳米，uvb波长为280-320纳米，uvc波长为100-280纳米。uvc在进入大气层时，已基本被臭氧层离隔；因此会对皮肤造成一定伤害的主要是uvb和uva。

2、过量的紫外线会损伤皮肤细胞，还会加速皮肤衰老、导致皮肤表面粗糙，角质层增生等许多皮肤问题，严重情况下还可能导致皮肤癌。其中，uvb主要伤害皮肤表皮层，会直接造成表面皮肤晒黑或晒伤，而uva可以直达皮肤的真皮层，破坏皮肤内部的胶原蛋白和弹性纤维等，加速皮肤的老化。因此，皮肤光损伤的原因及防治方法一直是研究热点。

3、永生化的人类角质形成细胞系hacat，因其高度保存的分化能力而常被用作皮肤角质形成细胞体外培养的典型细胞系。永生化角质形成细胞系hacat虽然细胞遗传学异常，但在体内和体外条件下均表现出很高的分化潜能，已被广泛用作正常人角质形成细胞的替代品，用于皮肤生物学方面的基础研究。实验发现，常规培养条件下的hacat细胞对uvb照射较为敏感，因此hacat也常作为细胞模型用于皮肤表皮光损伤方面研究。

4、但常规培养条件下的hacat细胞在模拟真实表皮光损伤方面，有很大的局限性。主要体现在如下方面：

5、1)真实皮肤表面有一层由死亡细胞自然形成的角质层保护，且为多细胞层结构，而平面培养的单层hacat细胞则缺乏该层结构；

6、2)传统细胞培养时浸没于液体培养基中，在进行线外光照时，紫外线需要首先穿过液体层，无法真实模拟紫外线对皮肤的直接损伤作用。

7、因此，建立一种更加仿真的基于hacat细胞的皮肤紫外光照损伤模型是非常有意义的。

技术实现思路

1、本发明提供了一种以永生化角质形成细胞hacat作为细胞来源的皮肤模型，即一种新型紫外uvb对表皮的光照损伤模型，适用于紫外线损伤机理研究以及抗紫外线保护剂的功效评价及筛选。

2、本发明所提供的以永生化角质形成细胞hacat作为细胞来源的皮肤模型，其构建方法如下：

3、1)将人真皮成纤维细胞hsf与i型鼠尾胶原蛋白混合制备成凝胶溶液；

4、所述的凝胶溶液中人真皮成纤维细胞hsf的浓度为1×106-2×106cells/ml：i型鼠尾胶原蛋白的浓度为0.5-1.5mg/ml；

5、2)将凝胶溶液加入到培养孔中，待凝胶溶液凝固硬化后，将hacat细胞悬液接种到凝胶上进行培养，培养至凝胶收缩至大小稳定并从培养孔分离；

6、所述的培养条件，是在37℃的5％co2培养箱中进行培养；

7、3)取细胞滤筛放置在六孔板的培养孔中，加入培养液直到细胞滤筛的尼龙网被覆盖；然后将步骤2)中收缩分离后的凝胶放在筛网上，使hacat细胞面朝上，添加培养液使凝胶主体浸入培养液且上表面暴露于空气中，培养2周后制成皮肤细胞模型；

8、所述的细胞滤筛的孔径为40μm；

9、在此步骤中，培养过程中每天更换培养液；

10、所述培养液，其一种具体组成如下：dmem培养基和f12培养基的混合液(dmem与f12培养基体积比为3：1),10％胎牛血清(fbs)，1％青链霉素。

11、本发明的皮肤模型用于药物筛选及药效评价。

12、本发明提供的皮肤模型与hacat单细胞层相比，对紫外光照的耐受性增强，皮肤仿真性更高。经uvb光照激后，细胞活力显著下降，炎症因子分泌量显著升高，说明该模型对紫外光照具有良好的关联性。使用紫外线防护剂维甲酸预处理过的皮肤模型接受uvb刺激后，各项检测指标均显示损伤程度降低，说明该模型适用于药物筛选及药效评价。

技术特征：

1.一种皮肤细胞模型，其特征在于，所述的皮肤细胞模型是使用如下方法构建的：

2.如权利要求1所述的皮肤细胞模型，其特征在于，所述的1)中凝胶溶液中人真皮成纤维细胞hsf的浓度为1×106-2×106cells/ml。

3.如权利要求1所述的皮肤细胞模型，其特征在于，所述的1)中i型鼠尾胶原蛋白的浓度为0.5-1.5mg/ml。

4.如权利要求1所述的皮肤细胞模型，其特征在于，所述的2)中的培养，是在37℃的5％co2培养箱中进行培养。

5.如权利要求1所述的皮肤细胞模型，其特征在于，所述的3)中的细胞滤筛的孔径为40μm。

6.如权利要求1所述的皮肤细胞模型，其特征在于，所述的3)中的培养过程中每天更换培养液。

7.如权利要求1所述的皮肤细胞模型，其特征在于，所述的培养液为dmem培养基和f12培养基的混合液,其中添加有10％胎牛血清和1％青链霉素。

8.如权利要求7所述的皮肤细胞模型，其特征在于，所述的dmem培养基和f12培养基的体积比为3：1。

9.权利要求1所述的皮肤细胞模型在治疗皮肤光照损伤药物的筛选或药效评价中的应用。

10.一种筛选治疗皮肤光照损伤药物的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的皮肤细胞模型来进行筛选。

技术总结
本发明提供一种用HaCaT细胞构建的皮肤细胞紫外线损伤模型，应用于皮肤紫外线光照损伤研究领域。本发明提供的皮肤细胞模型经UVB光照刺激后，细胞活力显著下降，炎症因子分泌量显著升高，说明该模型对紫外线光照敏感。使用抗紫外线保护剂维甲酸预处理过的皮肤模型接受UVB刺激后，各项检测指标均显示损伤程度降低，说明该模型适用于抗紫外线保护剂的功效评价、筛选以及皮肤紫外线损伤机理的研究。

技术研发人员：吴松洁,段治
受保护的技术使用者：青岛蔚蓝生物集团有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12