1.本发明涉及一种一种固定化链孢霉菌的制备方法，属于生物制药领域。
背景技术：
2.d-泛酸是维生素b族物质，是辅酶a的组成部分，广泛参与糖、脂肪、蛋白质代谢。d-泛酸有利于各种营养物质的吸收和利用。因此，d-泛酸广泛用于医药、食品、饲料工业等。但因d-泛酸不稳定，其盐的形式——d-泛酸钙就成为研究的热点。而d-泛酸钙的合成核心步骤就是泛酸内酯的手性拆分。
3.现在工业上制备d-泛酸内酯有两种方法，方法一是化学法，使用手性拆分剂对消旋泛酸内酯进行拆分，但是由于手性拆分剂价格昂贵、拆分成本高、有一定的环境污染，因此限制了此方法的使用和推广；方法二是微生物酶法拆分泛酸内酯得到d-泛酸内酯，此方法具有成本低，反应条件温和，环境污染小的优点，但也有缺点，生物酶无法回收再利用，大大增加了其成本。因此，生物酶的固载成为研究的热点。
4.对生物酶固载常用的方法为海藻酸钠包埋法，此方法操作简单、固载后的生物酶的活性较好，但机械强度低，重复使用后，容易破碎，从而导致生物酶流失，从而催化剂失活而无法重复使用。
技术实现要素：
5.为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种固定化链孢霉菌的制备方法，此方法先使用多孔沸石吸附菌液，后加入海藻凝胶包埋的方法对链孢霉菌进行固载。
6.本发明所采用的技术方案流程如下：一种固定化链孢霉菌的制备方法，其特征在在于包含以下步骤：s1菌液制备步骤：将甘油、蛋白胨、酵母膏、玉米浆按照一定比例配置培养液，在121℃下高温灭菌30分钟，冷却后，按一定接种量取链孢霉菌液接种后，30℃恒温培养一定时间，得到待固载菌丝细胞；s2沸石吸附步骤： 一定型号的多孔沸石用蒸馏水洗净，沸水煮一定时间，蒸馏水洗成中性，粉碎至一定规格，在121℃下湿热灭菌30min，烘干冷却。按一定质量比与菌液进行混合，30℃搅拌一定时间，得到沸石吸附固载的链孢霉菌；s3海藻酸钙凝胶包埋固载步骤：向上述反应液加入一定浓度的海藻酸钠，混合均匀，20℃搅拌一定时间，过滤。滤饼加入到一定浓度的氯化钙溶液，形成包裹沸石的海藻酸钙凝胶的颗粒沉淀。
7.优选的，步骤s1所述的甘油、蛋白胨、酵母膏、玉米浆配置培养液的比例为：2%:1%:1%:1%，所述的接种量为5%-10%，所述的培养时间为36h-72h。
8.优选的，步骤s2所述的一定型号的分子筛包括3a分子筛、4a分子筛、5a分子筛、13x分子筛，优选4a分子筛，所述的粉碎的规格为60目-100目，所述的沸石与培养液的质量比为1:20，所述的搅拌固载时间为48h-72h。
9.优选的，步骤s3所述的海藻酸钠的浓度为10g/l-30g/l，所述的搅拌时间为1h-2h，所述的氯化钙的浓度为10g/l-20g/l。
10.与现有技术相比，本发明有以下的创新点：
①
本工艺使用的是先固载到分子筛上，再用海藻酸钙凝胶包埋法进一步固定，因此，此催化剂固载的更加牢固，重复使用五次，未见催化性能有明显的降低，较现有固载型催化剂，重复使用率提高，大大降低了生产成本；
②ꢀ
本工艺固载及重复使用的步骤简单、实用，利于工业化生产。
附图说明
11.图1为本发明技术方案流程图。
具体实施方式
12.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
13.实施例1（1）菌液制备步骤：将甘油、蛋白胨、酵母膏、玉米浆按照2%:0.5%:1%:1%比例配置培养液，在121℃下高温灭菌30分钟，冷却后，按10%接种量取链孢霉菌液接种后，30℃恒温培养72h，得到待固载菌丝细胞；（2）沸石吸附步骤： 球型4a沸石分子筛用蒸馏水洗净，沸水煮2h，蒸馏水洗成中性，粉碎至100目，在121℃下湿热灭菌30min，烘干冷却。按1:20的质量比与菌液进行混合，30℃搅拌72h，得到沸石吸附固载的链孢霉菌；（3）海藻酸钙凝胶包埋固载步骤：向上述100ml反应液加入30g/l的海藻酸钠溶液 ，混合均匀，20℃搅拌2h，过滤。滤饼加入到20g/l的氯化钙溶液，形成包裹沸石的海藻酸钙凝胶的颗粒沉淀，静置2h，过滤，真空干燥得到固载型链孢霉菌。
14.实施例2（1）菌液制备步骤：将甘油、蛋白胨、酵母膏、玉米浆按照2%:0.5%:1%:0.5%比例配置培养液，在121℃下高温灭菌30分钟，冷却后，按10%接种量取链孢霉菌液接种后，30℃恒温培养72h，得到待固载菌丝细胞；（2）沸石吸附步骤： 球型5a沸石分子筛用蒸馏水洗净，沸水煮2h，蒸馏水洗成中性，粉碎至200目，在121℃下湿热灭菌30min，烘干冷却。按1:40的质量比与菌液进行混合，30℃搅拌72h，得到沸石吸附固载的链孢霉菌；（3）海藻酸钙凝胶包埋固载步骤：向上述100ml反应液加入30g/l的海藻酸钠溶液 ，混合均匀，20℃搅拌2h，过滤。滤饼加入到20g/l的氯化钙溶液，形成包裹沸石的海藻酸钙凝胶的颗粒沉淀，静置2h，过滤，真空干燥得到固载型链孢霉菌。
15.实施例3（1）菌液制备步骤：将甘油、蛋白胨、酵母膏、玉米浆按照2.5%:1%:1%:0.5%比例配置培养液，在121℃下高温灭菌30分钟，冷却后，按15%接种量取链孢霉菌液接种后，30℃恒
温培养72h，得到待固载菌丝细胞；（2）沸石吸附步骤： 球型3a沸石分子筛用蒸馏水洗净，沸水煮2h，蒸馏水洗成中性，粉碎至100目，在121℃下湿热灭菌30min，烘干冷却。按1:20的质量比与菌液进行混合，30℃搅拌72h，得到沸石吸附固载的链孢霉菌；（3）海藻酸钙凝胶包埋固载步骤：向上述100ml反应液加入20g/l的海藻酸钠溶液 ，混合均匀，20℃搅拌2h，过滤。滤饼加入到20g/l的氯化钙溶液，形成包裹沸石的海藻酸钙凝胶的颗粒沉淀，静置2h，过滤，真空干燥得到固载型链孢霉菌；固定化细胞酶活力的测定方法：以包埋量为1g湿菌丝体的固定化细胞，加tris-hcl缓冲液配置成的10%（质量百分比浓度）的泛酸内酯50ml，于30℃、150r/min摇床反应1h，抽滤取清液，hplc方法分析。以1g湿菌丝体在相同条件下的反应结果作为参比。
16.重复使用实验：取10%菌体包埋量的固定化催化剂30g，加入到50ml10%的泛酸内酯的tris-hcl缓冲液中，以24h为一个周期进行水解，反应完毕，过滤，用清水洗涤，再进行下次循环反应，循环5此，未见酶反应的水解率下降。
17.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：
1.一种固定化链孢霉菌的制备方法，其特征在在于包含以下步骤：s1菌液制备步骤：将甘油、蛋白胨、酵母膏、玉米浆按照一定比例配置培养液，在121℃下高温灭菌30分钟，冷却后，按一定接种量取链孢霉菌液接种后，30℃恒温培养一定时间，得到待固载菌丝细胞；s2沸石吸附步骤： 一定型号的多孔沸石用蒸馏水洗净，沸水煮一定时间，蒸馏水洗成中性，粉碎至一定规格，在121℃下湿热灭菌30min，烘干冷却，按一定质量比与菌液进行混合，30℃搅拌一定时间，得到沸石吸附固载的链孢霉菌；s3海藻酸钙凝胶包埋固载步骤：向上述反应液加入一定浓度的海藻酸钠，混合均匀，20℃搅拌一定时间，过滤，滤饼加入到一定浓度的氯化钙溶液，形成包裹沸石的海藻酸钙凝胶的颗粒沉淀。2.根据权利要求1所述的一种固定化链孢霉菌的制备方法，其特征在于：步骤s1所述的甘油、蛋白胨、酵母膏、玉米浆配置培养液的比例为：2%:1%:1%:1%，所述的接种量为5%-10%，所述的培养时间为36h-72h。3.根据权利要求1所述的一种固定化链孢霉菌的制备方法，其特征在于：步骤s2所述的一定型号的分子筛包括3a分子筛、4a分子筛、5a分子筛、13x分子筛，优选4a分子筛，所述的粉碎的规格为60目-100目，所述的沸石与培养液的质量比为1:20，所述的搅拌固载时间为48h-72h。4.根据权利要求1所述的一种固定化链孢霉菌的制备方法，其特征在于：步骤s3所述的海藻酸钠的浓度为10g/l-30g/l，所述的搅拌时间为1h-2h，所述的氯化钙的浓度为10g/l-20g/l。
技术总结
本发明提供了一种固定化链孢霉菌的制备方法，此方法先使用多孔沸石吸附菌液，后加入海藻凝胶包埋的方法对链孢霉菌进行固载。此方法使用的是先固载到分子筛上，再用海藻酸钙凝胶包埋法进一步固定，固载的更加牢固，重复使用五次，未见催化性能有明显的降低，较现有固载型催化剂，重复使用率提高，大大降低了生产成本。成本。成本。
技术研发人员：熊沣 徐勇 向婷
受保护的技术使用者：湖北楚维药业有限公司
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2022/2/28