针对抗原NY-ESO-1的MHCI和MHCII表位的癌症组合T细胞受体基因疗法的制作方法

针对抗原ny-eso-1的mhci和mhcii表位的癌症组合t细胞受体基因疗法
1.本技术是申请日为2016年3月11日的中国专利申请201680015622.9“针对肿瘤抗原ny-eso-1的mhc i和mhc ii-限制表位的癌症的组合t细胞受体基因疗法”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及免疫疗法领域，特别是癌症的过继性t细胞疗法或t细胞受体(tcr)基因疗法。本发明提供编码tcr构建体的至少一种t细胞受体α链构建体和/或tcr β链构建体的核酸，所述tcr构建体能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1 (也称为ctag-1)的表位，其中tcr α链构建体和/或tcr β链构建体包含与选自seq id no: 1-20的氨基酸具有至少90%的序列同一性的互补决定区3 (cdr3)。本发明提供限制于来自存在于mhc i上的ny-eso-1的表位的tcr构建体，和限制于来自存在于mhc ii分子上的ny-eso-1的表位的tcr构建体，从而使得含重组cd4+和重组cd8+ t细胞二者的组合过继性t细胞疗法成为可能。本发明还提供对应的蛋白和宿主细胞，以及这样的构建体的医学应用，特别是在增生性或病毒性疾病的诊断、预防和/或治疗中的医学应用，其中，优选地，限制于mhc i和mhc ii分子的两种tcr构建体在药剂盒中提供。本发明还涉及人tcr基因座和人hla-dr4的转基因小鼠，ababdr4小鼠。


背景技术：

3.尽管对诊断患有癌症的患者可用的诊断和治疗选项有显著的技术进步，预后通常仍然是差的并且许多患者不能被治愈。免疫疗法对诊断患有各种肿瘤的患者的有效(仍是靶向)治疗保持有前景，具有根除恶性肿瘤细胞而不损害正常组织的可能性。理论上，免疫系统的t细胞能够识别对肿瘤细胞特异性的蛋白模式并通过多种效应机制介导它们的破坏。然而，在实践中，患者的t细胞通常对肿瘤抗原是耐受的。过继性t-细胞疗法试图利用和放大患者自身t细胞的肿瘤-根除能力，然后将这些t细胞以它们有效地消除残余肿瘤，但不损害健康组织的这样一种状态返回给患者。虽然这种方法对肿瘤免疫学领域并不是新的，但在过继性t细胞疗法的临床用途中的许多缺点仍损害这种方法在癌症治疗中的全面应用。
4.tcr是免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白，其与参与介导信号转导的cd3复合体的不变蛋白关联。tcr以αβ和γδ形式存在，其在结构上是类似的，但有截然不同的结构位置和可能有截然不同的功能。天然的异二聚体αβtcr的α和β链是跨膜蛋白，其各自包含两个细胞外结构域，一个近膜恒定结构域，和一个远膜可变结构域。每个恒定和可变结构域包括链内二硫键。可变结构域包含类似于抗体的互补决定区(cdr)的高度多态环。
5.每个tcr链的可变区包含可变和连接段，和在β链的情况下也包含多样性段。每个可变区包含嵌入在框架序列中的3个cdr (互补决定区)，一个是称为cdr3的高变区。存在由它们的框架，cdr1和cdr2序列，和由部分限定的cdr3序列鉴别的几种类型的α链可变(vα)区和几种类型的β链可变(vβ)区。独特的trav或trbv号通过imgt命名法给予vα或vβ。t细胞受
(也即：ctag-1)的表位，其中tcr α链构建体和/或tcr β链构建体包含互补决定区3 (cdr3)，其具有与选自seq id no: 1-20的氨基酸至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或优选100%的序列同一性。
14.在本发明的上下文中，“a”被理解为意指“一个或多个”，除非另外明确说明。因此，例如，如果本发明的tcr构建体包含α和β链构建体二者，如为整个发明首选的，它可由者一个或者两个核酸编码。α和β链构建体一起能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位。如同中间产物，α和β链构建体本身也是本发明的主题。
15.seq id no: 1-20对应于本发明鉴定的tcr的cdr3区并示于本技术的表1和2中。seq id no: 1-9对应于本发明的tcr α链构建体的cdr3区，其能够识别hla-dra/hla-drb1*0401 (hla-dr4)-，即mhc ii-限制的ny-eso-1
116-135
表位(lpvpgvllkeftvsgnilti, seq id no: 21)，seq id no: 10-18对应于本发明的tcr β链构建体的cdr3区，其能够识别hla-dr4-限制的ny-eso-1
116-135
表位。这些是首次分离的对ny-eso-1的hla-dr4-限制的表位有特异性的tcr。它们源自人tcr基因座和人hla-dr4的转基因小鼠。
16.因此，在一个优选的实施方案中，本发明的tcr构建体能够特异性地结合由与hla-dr4复合的ny-eso-1
116-135
表位(seq id no: 21)组成的表位，其中tcr α链构建体包含与选自seq id no: 1-9的氨基酸具有至少90%序列同一性，优选100%序列同一性的cdr3。tcr β链构建体包含与选自seq id no: 10-18的氨基酸具有至少90%序列同一性，优选100%序列同一性的互补决定区3 (cdr3)。当然，tcr α和β链构建体以能够识别mhc分子上的表位的方式在本发明的tcr构建体中配对，特别是，如在表1中教导的。tcr α和/或β链构建体可包含在表3中示出的cdr1、cdr2和cdr3区。优选地，tcr α和/或β链构建体包含如在表1中所示的cdr3区和可变区。
17.tcr α链构建体可包含含有与seq id 22-30具有至少80%、至少90%或100%序列同一性的序列的可变区，其任选地由具有选自seq id 31-39的密码子-优化的序列的核酸编码。tcr α链构建体优选地包含具有与seq id no: 40-48的任一个至少80%、至少90%或100%序列同一性的序列，并任选地由具有seq id no: 49-57的任一个的序列的密码子-优化的核酸编码。
18.表1 从ababdr4小鼠分离的识别ny-eso-1
116-135
的hla-dr4限制的tcr的列表
tcr β链构建体可包含含有与seq id no: 58-66具有至少80%、至少90%或100%序列同一性的序列的可变区，其任选地由具有选自seq id no: 67-75的序列的密码子-优化的核酸编码。tcr β链构建体优选地包含具有与seq id no: 76-84的任一个至少80%、至少90%或100%序列同一性的序列并任选地由seq id no: 85-93的任一个的密码子-优化的核酸编码。
19.由在它们的可变区内或经历它们的全长的一定序列同一性限定的构建体优选地包含与限定的cdr3区(如例如在表1中所示的)具有100%同一性的各个cdr3区。
20.本发明还提供单链核酸构建体，其中，例如tcr α和β链构建体由p2a元件分离。在这样的单链核酸构建体中，完整的tcr构建体可由seq id no: 94-102的任一个的核酸编码。
21.本发明还涉及一种小鼠，其包含编码完整未重排的人tcr α和β基因座的核酸，并在其cd4+ t细胞上表达源自基因座的重排tcr，还表达融合至小鼠i-e的非-抗原-结合结构域的人hla-dr4，其中小鼠缺乏小鼠tcr和小鼠mhc ii类分子。因此，ababdr4用具有hla-dr4限制的cd4+ t细胞表达多样化的人tcr库。本发明的上述tcr构建体，其识别与hla-dr4复合的ny-eso-1表位，都源自这样的称为ababdr4小鼠的小鼠，这也是本发明的目的。本发明还涉及这些小鼠用于制备对存在于hla-dr4上的表位有特异性的tcr，特别是本发明的tcr构建体的用途。
22.与人类不同，ababdii小鼠或ababdr4小鼠对人肿瘤相关抗原(taa)，例如ny-eso-1是不耐受的。因此，当用人taa接种疫苗时，ababdii小鼠生成针对那些外来抗原的有效的适应性免疫应答，包括高亲合力抗原特异性t细胞的扩增。在用合适的人taa免疫后，可提取编码ababdii小鼠的高亲合力tcr的遗传信息。这些tcr可随后通过逆转录病毒转导，在来自肿瘤患者的t细胞中重新表达。那些重新定向的t细胞可转移回到与肿瘤作斗争的患者中(wo2014118236的图1)。
23.使用人tcr转基因小鼠，未由小鼠基因组编码的任何人肽序列因此适合于免疫并将产生具有最佳亲和力的tcr。最佳亲和力意指t细胞被限制于人自身-mhc分子并识别作为
异物的肽抗原，例如代表了非-耐受库。通过使用肽/mhc多聚体，转基因小鼠的特异性t细胞可被分选，例如通过单细胞pcr分离人tcr，为有效表达优化tcr，同时避免与内源性tcr错配并用来用病毒载体转导患者的t细胞(uckert et al., 2009, cancer immunol immunother 58, 809-22; kammertoens et al., 2009, eur j immunol 39, 2345-53。
24.本发明的上述tcr构建体源自人tcr基因座和人mhc (特别是hla-dr4)的转基因小鼠，即ababdr4小鼠。“源自”意欲指tcr构建体(或各自的α/β链构建体)的至少cdr3序列，优选地，可变区与在以下实施例中由小鼠tcr提供的序列相同或与以下实施例中小鼠tcr提供的序列具有以上限定的序列同一性水平。可能的是，但不需要，核酸在物理上源自(如通过pcr)编码小鼠tcr的核酸。如在其它地方详细描述的，修饰是可能的。
25.在ababdii小鼠中的cd8+ t细胞带有人t细胞受体(tcr)，其识别由人mhc i类分子呈递的抗原，hla-a*0201 (hla-a2) (li et al., 2010, nature medicine 16, 1029
–
34)。识别限制于hla-a2的ny-eso-1表位且源自ababdii小鼠的tcr先前已被描述(linnemann et al., nature medicine 19, 1534-1541)。本发明提供识别限制于hla-a2的ny-eso-1表位(seq id no: 103)和源自ababdii小鼠的tcr，其显示在功能上优于源自人患者的各个tcr，tcr 1g4。
26.表2 从ababdii小鼠分离的识别ny-eso-1
157-165
的tcr-eso序列因此，本发明还提供能够识别与mhc i (特别是hla-a2)组合的ny-eso-1表位的tcr构建体。seq id no: 19对应于本发明的tcr α链构建体的cdr3区，其能够识别hla-a2-，即mhc i-限制的ny-eso-1
157-165
表位(sllmwitqc, seq id no: 103)，seq id no: 20对应于本发明的tcr β链构建体的cdr3区，其能够识别hla-a2限制的ny-eso-1
157-165
表位。令人惊奇地发现，由本发明提供的这种tcr具有如下所示的比先前已从人分离的其它tcr更高的亲和力。
27.这种tcr构建体能够特异性地结合由与hla-a2复合的seq id no: 103组成的表位，其中tcr α链构建体包含具有与seq id no: 19至少90%序列同一性，优选100%序列同一性的互补决定区3 (cdr3)和/或tcr β链构建体包含具有与seq id no: 20至少90%序列同一性，优选100%序列同一性的互补决定区3 (cdr3)。
28.所述tcr α链构建体可包含含有与seq id 104具有至少80%、至少90%或100%序列同一性的序列的可变区，其任选地由seq id 105的密码子-优化的核酸编码。tcr α链构建体可包含与seq id no: 106具有至少80%、至少90%或100%序列同一性的序列，并任选地由seq id no: 107的密码子-优化的核酸编码。
29.所述tcr β链构建体可包含含有与seq id 106具有至少80%、至少90%或100%序列同一性的序列的可变区，其任选地由seq id 108的密码子-优化的核酸编码。tcr β链构建体可包含与seq id no: 109具有至少80%、至少90%或100%序列同一性的序列，其任选地由seq id no: 110的密码子-优化的核酸编码。
30.tcr构建体可包含示于表3的cdr1、cdr2和cdr3区。tcr构建体也可包含于表2中所
示的cdr3区和可变区。
31.表3 本发明的tcr构建体的cdr1、cdr2和cdr3本发明还提供单链核酸构建体，其中，例如tcr α和β链构建体由p2a元件分离。图4提供示例性构建体。这样的tcr构建体可由seq id no: 111的核酸编码。
32.以上提供的所有的核酸序列已被密码子-优化用于人细胞的表达。
33.本发明的tcr α链构建体和/或tcr β链构建体或tcr构建体优选地是载体。合适的载体包括设计用于增殖和扩大，或用于表达或二者的那些，例如质粒和病毒。载体可以是适合于在宿主细胞中表达的表达载体，所述宿主细胞选自人t细胞或人t细胞前体，优选地，人t细胞例如cd8+ t细胞、cd4+ t细胞、中枢-记忆t细胞、效应子-记忆t细胞、干细胞-样t细胞。载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒，特别是γ-逆转录病毒或慢病毒载体。合适的表达载体的实例包括示于图4的逆转录病毒载体mp71。重组表达载体包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，其对载体被引入其中且将在其中进行本发明核酸的表达的宿主细胞类型(如细菌、真菌、植物，或动物)是特异性的。而且，本发明的载体可包括一个或多个标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。重组表达载体可包含天然的或优选地，异源启动子，其可操作地连接于编码本发明的构建体的核苷酸序列，或连接于与编码本发明的构建体的核苷酸序列互补或与编码本发明的构建体的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。启动子的选择包括，如强、弱、诱导型、组织-特异性和发育-特异性启动子。启动子可以是非-病毒启动子或病毒启动子。优选地，它是异源启动子，即非天然连接于人t细胞的tcr的启动子，例如长末端重复启动子，其适合于人t细胞中表达。本发明的重组表达载体可被设计用于瞬时表达、稳定表达，或者二者。同样，重组表达载体可被制备用于组成型表达或用于诱导型表达。
eso-1的抗体结构域。
40.单链构建体(sctcr)以及异二聚体tcr构建体被包括在内。sctcr可包含第一个tcr链构建体(如α链)的可变区和整个(全长)第二个tcr链(如β链)，或反之亦然。而且，sctcr可任选地含一个或多个接头，其将两个或更多个多肽连接在一起。接头可以是例如将两个如本文描述的单链连接在一起的肽。本发明的这样一种sctcr也被提供，其融合于细胞因子，如人细胞因子，例如il-2、il-7或il-15。
41.根据本发明的tcr构建体也可以多聚体复合体的形式提供，其包含至少两个sctcr分子，其中所述sctcr分子各自融合于至少一个生物素部分，和其中所述sctcrs通过生物素-链霉抗生物素相互作用互相连接，以允许所述多聚体复合体形成。还提供高级多聚体复合体，其包含两个以上，如4个本发明的sctcr。
42.本发明的tcr构建体可被修饰以包含可检测的标记，例如，放射性同位素、荧光团(如异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe))、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)，和颗粒(如金粒或磁性颗粒)。
43.本发明还提供包含本发明的核酸或蛋白的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，如植物、动物、真菌，或藻类，或可以是原核细胞，如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体，如人中分离的。宿主细胞可以是粘附细胞或悬浮的细胞，即在悬液中生长的细胞。为了产生重组tcr、多肽或蛋白的目的，宿主细胞优选地是哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞是人细胞。虽然宿主细胞可具有任何细胞类型，可源自任何类型的组织，并可具有任何发育阶段，宿主细胞优选地是外周血白细胞(pbl)或外周血单核细胞(pbmc)。更优选地，宿主细胞是t细胞或t细胞前体，特别是，人t细胞。t细胞可以是任何t细胞，例如培养的t细胞，例如原代t细胞，或来自培养的t细胞系的t细胞，例如jurkat, suptl等，或从哺乳动物获得的t细胞，优选地，它是来自人患者的t细胞或t细胞前体。t细胞可从许多来源，例如血、骨髓、淋巴结、胸腺，或其它组织或液体获得。t细胞也可被富集或纯化。优选地，t细胞是人t细胞。更优选地，t细胞是从人，如人患者分离的t细胞。t细胞可以是任何类型的t细胞并可具有任何发育阶段，包括但不限于，cd4+和/或cd8+、cd4+辅助t细胞，如th1和th2细胞、cd8+ t细胞(如细胞毒性t细胞)、肿瘤浸润细胞(tils)、效应细胞、中枢效应细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞等，优选中枢-记忆t细胞。
44.优选地，宿主细胞是人cd4-阳性t细胞，其中本发明的tcr构建体被限制于mhc ii表位，或人cd8-阳性t细胞，其中本发明的tcr构建体被限制于mhc i表位。
45.本发明还提供一种药用组合物，其包含a) 核酸，优选地，表达载体，其适合于在人t细胞中表达，编码本发明的tcr构建体，所述tcr构建体能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位，或b) 包含本发明的tcr构建体的蛋白，所述tcr构建体能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位，或c) 本发明的宿主细胞，如人t细胞，其表达能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位的tcr构建体。
46.在一个优选的实施方案中，用于药用组合物的本发明的tcr构建体是如本文公开的、能够识别限制于hla-dr4的表位的tcr构建体。
47.备选地，tcr构建体是如本文公开的、能够识别限制于hla-a02的表位的本发明的
tcr构建体。
48.本发明还提供一种优选地用于医学，特别是用于治疗人患者的药剂盒，其包含，作为第一组分a) 核酸，优选地，表达载体，编码能够特异性地结合来自与人mhc ii复合的限定抗原的表位的tcr构建体，或b) 蛋白，其包含能够特异性地结合来自与人mhc ii复合的限定抗原的表位的tcr构建体，或c) 宿主细胞，其表达能够特异性地结合来自与人mhc ii复合的限定抗原的表位的tcr构建体，和i) 核酸，优选地，表达载体，其编码能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体，或ii) 蛋白，其包含能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体，或iii) 宿主细胞，其表达能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体。
49.所述限定的抗原优选地是选自癌症-睾丸-抗原例如ny-eso-1的肿瘤-相关或肿瘤-特异性抗原。特别是，表位分别是seq id no: 21 (hla-dr4-限制)和103 (hla-a02-限制)的表位。备选地，抗原可以是体细胞突变抗原、病毒抗原、肿瘤驱动抗原(tumor driving antigen)、肿瘤-相关抗原、分化抗原如癌症-睾丸抗原。优选地，tcr构建体是人tcr，基本上人tcr，如上所述，或源自人tcr，如源自如上所述的人源化小鼠。
50.到目前为止，过继性t细胞转移至人只专注于给予cd8+或者cd4+ t细胞。然而，本发明人已提供在人中进行过继性t细胞疗法的方法，其包括具有对限定的肿瘤相关抗原ny-eso-1有特异性的tcr构建体的cd8+和cd4+ t细胞的转移，其允许两种细胞类型的合作。备选地，编码所述tcr构建体的核酸或各个蛋白也可被用来转移所需特异性至患者的内源性t细胞。cd4+细胞，如通过分泌细胞因子例如ifn-γ和il-2，可促进cd8+细胞募集至肿瘤并发挥细胞溶解的功能。这能够更有效地消除肿瘤细胞，和退化或优选地消除肿瘤。优选没有复发。
51.特别是，本发明提供如上所述的药剂盒，其包含所述药用组合物，所述药用组合物含有，作为第一组分，a) 核酸，优选地，表达载体，其适合于在人t细胞中表达，编码本发明的tcr构建体，所述tcr构建体能够特异性地结合来自与人hla-dr4复合的ny-eso-1的表位，并包含与seq id no: 1-18的任一个具有优选地至少80%序列同一性的cdr3区，b) 蛋白，其包含本发明的tcr构建体，所述tcr构建体能够特异性地结合来自与人hla-dr4复合的ny-eso-1的表位，且包含与seq id no: 1-18的任一个具有优选地至少80%序列同一性的cdr3区，或c) 本发明的宿主细胞，如人t细胞，其表达tcr构建体，所述tcr构建体能够特异性地结合来自与hla-dr4复合的ny-eso-1的表位，且包含与seq id no: 1-18的任一个具有优选地至少80%序列同一性的cdr3区。
52.所述药剂盒优选地包含作为第二组分的药用组合物，其包含i) 核酸，优选地，表达载体，其编码能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体，如本发明的tcr构建体，其包含与seq id no: 19-20具有优选地至少80%序列同一性的cdr3区，或ii) 蛋白，其包含能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体，如本发明的tcr构建体，其包含与seq id no: 19-20具有优选地至少80%序列同一性的cdr3区，或iii) 宿主细胞，其表达能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体，如本发明的tcr构建体，其包含与seq id no: 19-20具有优选地至少80%序列同一性的cdr3区。
53.本发明的药剂盒的组分可被配制用于同时给予或以任何顺序给予。所述组分也可重复给予。tran et al. (science, 2014年5月9日；344 (6184): 641-5)描述了一种可能的给药方案。
54.可用于本发明的药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括稳定剂例如spga、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐)，蛋白例如白蛋白或酪蛋白，包含蛋白的试剂例如牛血清或脱脂乳和缓冲剂(如磷酸盐缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水)。
55.本发明的药用组合物或本发明的药剂盒可被用于诊断、预防和/或治疗疾病，例如增生性、感染性或病毒性疾病。疾病优选地为肿瘤疾病，例如良性或恶性肿瘤疾病。在一个优选的实施方案中，增殖性细胞或肿瘤表达ny-eso-1，和tcr构建体能够识别来自ny-eso-1的至少一个表位。优选地，疾病被治疗。得病的风险的减少也被认为是预防疾病，优选地，经治疗的受试者的风险被减少至低于在比较人群中的正常水平，优选地，风险被减少至少10%、至少25%、至少50%或至少75%，或100%。
56.本发明还提供一种治疗罹患如上面指定的疾病，特别是，肿瘤或肿瘤疾病的受试者的方法，其包括给予本发明的核酸、蛋白或宿主细胞。优选地，受试者是需要这样的治疗的受试者，即患者。在优选的实施方案中，受试者是哺乳动物受试者，优选罹患肿瘤或肿瘤疾病的人患者。活性剂以有效量给予。
57.在本发明的上下文中，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”表示选自黑素瘤、肝细胞癌、肝内和肝外胆血管细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌以及未分化的头、颈、肺或食管癌、直肠结肠癌、软骨肉瘤、骨肉瘤、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、头或颈的非-鳞状细胞癌、卵巢肿瘤、淋巴瘤、急性和慢性淋巴细胞性白血病、急性和慢性骨髓性白血病、膀胱癌、前列腺癌、胰腺腺癌、乳腺癌和胃癌的疾病。表达ny-eso-1的肿瘤优选地选自黑素瘤、肺癌、滑膜肉瘤，和头颈癌、食管癌和膀胱癌。
58.本发明的一个优选的医学用途涉及免疫疗法，优选过继性t细胞疗法。本发明的产品和方法特别可用于过继性t细胞疗法的情况。给予本发明的化合物可例如包括给予，例如输注本发明的t细胞至所述患者。优选这样的t细胞是用本发明的核酸体外转导的患者的自体t细胞。
59.备选地，患者也可给予本发明的核酸，特别是表达载体，用于t细胞体内转导。
60.本发明的蛋白tcr构建体还可例如用于发现受试者是否表达ny-eso-1，且特别是，是否是根据seq id no: 21的表位的诊断目的。为此，这样的构建体优选被标记以便于检
测。优选地，在hla-dr4上呈递所述表位的患者通过本发明的过继性t细胞疗法治疗。
61.本发明还涉及一种制备本发明的宿主细胞的方法，其包括引入编码能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位的tcr构建体的表达载体至合适的宿主细胞，优选地，从患者分离的人t细胞中。
附图说明
62.本发明在以下实施例中参考附图和序列得到进一步的说明，然而并不限于此。为了本发明的目的，在此引用的所有参考文献通过引用以其整体结合到本文中。
63.图1 得自ababdii小鼠的ny-eso157-特异性tcr-eso与患者-衍生的tcr 1g4的功能比较. (a) 得自人供体的pbmc用ababdii-衍生的tcr-eso或人-衍生的tcr 1g4转导并用ny-eso157-hla-a2-特异性多聚体染色。门控cd3+细胞。(b) t2细胞用递增量的ny-eso157天然的肽脉冲并与tcr-转导的t细胞共培养。(c) 通过tcr-转导的t细胞与不同的肿瘤细胞系(sk.mel37: hla-a2+/ny-eso+，sk.mel29.mig: hla-a2+/ny-eso
−
，sk.mel29.mig.ny-eso: hla-a2+/ny-eso+，mel324: hla-a2+/ny-eso
−
，mel295；hla-a2+/ny-eso+)共培养后生产ifnγ。b和c中的图表示测定内重复的平均数
±ꢀ
s.d。
64.图2 对于整个tcrαβ基因座和对于融合于小鼠i-e的非-抗原-结合结构域的人mhc ii类分子hla-dr4，ababdr4小鼠是转基因的。ababdr4小鼠对于小鼠tcr和小鼠mhc ii类分子是缺乏的。因此，ababdr4用具有hla-dr4限制的cd4 t细胞表达多样化的人tcr库。
65.图3 得自用ny-eso-1 dna免疫的ababdr4小鼠的外周血白细胞用抗-cd3/cd28 dynabead、不相关的肽，或ny-eso
116-135
再刺激过夜并对ifnγ细胞内染色。对淋巴细胞和cd3阳性细胞门控标绘的细胞。
66.图4 逆转录病毒tcr-载体mp71的结构示意图(linnemann et al., 2013, nature medicine 19, 1534-1541)。
67.图5 tcr-缺乏和表达cd4的jurkat细胞用ny-eso-1-反应性tcr转导并用ny-eso-1
116-135
/dr4-四聚体(ny-eso-1 tet)或clip/dr4-四聚体(clip tet)作为对照染色。
68.图6 来自人pbmc的tcr-转导的或非-转导的(对照) cd4+ t细胞与天然表达hla-dr4和/或ny-eso-1的不同的黑素瘤细胞系共培养并对ifnγ进行细胞内染色。显示的百分比是指转导的cd4+ t细胞(tcr-转导的样品)或总cd4+ t细胞(非-转导的样品)。显示了重复的平均值与标准偏差。通过流式细胞术分析所有黑素瘤细胞系的hla-dr表达。
69.图7 ababdr4小鼠-衍生的但并非人-衍生的ny-eso-1
116-135-反应性tcr识别表达hla-dr4/ny-eso-1的黑素瘤细胞系。用源自ababdr4小鼠(3600、5712、3598_2)或源自健康人供体(ny1、ny2、ny3)的ny-eso-1
116-135-反应性tcr转导的cd4 t细胞与ifnγ-预处理的表达hla-dr4和/或ny-eso-1的黑素瘤细胞系共同培养。加入ny-eso-1
116-135
肽(ny116)作为阳性对照。培养过夜后，在上清液中测定ifnγ。显示了测定内重复的平均值与标准偏差。通过流式细胞术分析所有黑素瘤细胞系的hla-dr表达。
70.图8 用ny-eso-1-反应性tcr转导的cd8和cd4 t细胞在肿瘤细胞杀伤中显示出协作效应。tcr-eso-转导的cd8 t细胞和/或tcr3598_2-转导的cd4 t细胞与cfse-标记的黑素瘤细胞系fm-3一起培养，所述黑素瘤细胞系fm-3用ny-eso-1
116-135
和ny-eso-1
157-165
肽载荷(低cfse荧光)和未载荷(高cfse荧光)。cfse-标记的靶和对照细胞以1:1的比例，各8x104个
细胞培养。tcr-转导的cd8和cd4 t细胞数各自是6x104。培养过夜后，fm-3的细胞数通过流式细胞术测量。(a) 与tcr-转导的t细胞一起培养后的fm-3细胞的代表性直方图被示出。数目表示ny-eso-1肽-载荷的fm-3细胞的百分比(小箭头)。(b) 条形图表明如a中所示通过杀伤靶细胞测定的tcr-转导的cd4和/或cd8 t细胞的细胞毒性。显示了测定内重复的平均值与标准偏差。
具体实施方式
71.编码tcr构建体的至少一种t细胞受体(tcr) α链构建体和/或tcr β链构建体的核酸，所述tcr构建体能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位，其中tcr α链构建体和/或tcr β链构建体包含与选自seq id no: 1-20的氨基酸具有至少90%的序列同一性的互补决定区3 (cdr3)。
72.实施方案1的核酸，其中tcr构建体能够特异性地结合由与hla-dr4复合的seq id:21组成的表位，其中tcr α链构建体包含与选自seq id no: 1-9的氨基酸具有至少90%序列同一性，优选地，100%序列同一性的cdr3和/或tcr β链构建体包含与选自seq id no: 10-18的氨基酸具有至少90%序列同一性，优选地，100%序列同一性的互补决定区3 (cdr3)。
73.实施方案2的核酸，a) 其中tcr α链构建体包含含有与seq id 22-30具有至少80%序列同一性的序列的可变区，其任选地由选自seq id 31-39的序列编码，其中tcr α链构建体优选地包含与seq id no: 40-48的任一个具有至少80%序列同一性的序列并任选由seq id no: 49-57的任一个编码，b) 和/或其中tcr β链构建体包含含有与seq id 58-66具有至少80%序列同一性的序列的可变区，其任选地由选自seq id 67-75的序列编码，其中tcr β链构建体优选地包含与seq id no: 76-84的任一个具有至少80%序列同一性的序列且任选地由seq id no: 85-93的任一个编码，c) 其中tcr构建体优选地由seq id no: 94-102的任一个编码；d) 其中tcr α链构建体和/或tcr β链构建体或tcr构建体优选地是适合于在选自人t细胞的宿主细胞中表达的表达载体。
74.实施方案1的核酸，其中tcr构建体能够特异性地结合由与hla-a2复合的seq id:103组成的表位，其中tcr α链构建体包含与seq id no: 19具有至少90%序列同一性，优选地，100%序列同一性的互补决定区3 (cdr3)和/或tcr β链构建体包含与seq id no: 20具有至少90%序列同一性，优选地，100%序列同一性的互补决定区3 (cdr3)。
75.实施方案4的核酸，a) 其中tcr α链构建体包含含有与seq id 104具有至少80%序列同一性的序列的可变区，其任选地由seq id 105编码，其中tcr α链构建体优选地包含与seq id no: 106具有至少80%序列同一性的序列并任选地由seq id no: 107编码，b) 和/或其中tcr β链构建体包含含有与seq id 108具有至少80%序列同一性的序列的可变区，其任选地由seq id 109编码，其中tcr β链构建体优选地包含与seq id no: 110具有至少80%序列同一性的序列并任选地由seq id no: 111编码，c) 其中tcr构建体优选地由seq id no: 112编码，
d) 其中tcr α链构建体和/或tcr β链构建体或tcr构建体优选地是适合于在选自人t细胞的宿主细胞中表达的表达载体。
76.一种蛋白，其由任一项前述实施方案的核酸编码。
77.一种包含任一项前述实施方案的核酸或蛋白的宿主细胞，其中宿主细胞优选地是cd4+ t细胞和核酸是实施方案2-3的任一项的核酸，或其中宿主细胞优选地是cd8+ t细胞和核酸是实施方案4-5的任一项的核酸，其中宿主细胞优选地是人细胞。
78.一种药用组合物，其包含a) 实施方案1-5的任一项的核酸，其编码能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位的tcr构建体，或b) 实施方案6的蛋白，其包含能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位的tcr构建体，或c) 实施方案7的宿主细胞，其表达能够特异性地结合来自与人mhc复合的ny-eso-1的表位的tcr构建体。
79.实施方案8的药用组合物，其包含实施方案2-3的任一项的核酸、由所述核酸编码的蛋白或包含所述核酸的宿主细胞。
80.实施方案8的药用组合物，其包含实施方案4-5的任一项的核酸、由所述核酸编码的蛋白或包含所述核酸的宿主细胞。
81.一种用于医学的药剂盒，其包含，作为第一组分a) 核酸，其编码能够特异性地结合来自与人mhc ii复合的限定抗原的表位的tcr构建体，或b) 蛋白，其包含能够特异性地结合来自与人mhc ii复合的限定抗原的表位的tcr构建体，或c) 宿主细胞，其表达能够特异性地结合来自与人mhc ii复合的限定抗原的表位的tcr构建体，和i) 核酸，其编码能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体，或ii) 蛋白，其包含能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体，或iii) 宿主细胞，其表达能够特异性地结合来自与人mhc i复合的所述限定抗原的表位的tcr构建体，其中所述限定的抗原优选地是选自癌症-睾丸-抗原例如ny-eso-1的肿瘤-相关的或肿瘤-特异性的抗原。
82.实施方案11的药剂盒，其包含作为第一组分的实施方案9的药用组合物，和优选地，作为第二组分的实施方案10的药用组合物，其中两种组分被配制用于同时给予或以任何顺序给予。
83.实施方案8-10的任一项的药用组合物或实施方案11或12的任一项的药剂盒，其用于增生性或病毒性疾病，优选良性或恶性肿瘤疾病的诊断、预防和/或治疗，其中增殖性细胞或肿瘤表达ny-eso-1。
84.实施方案13中使用的药用组合物或药剂盒，其用于免疫疗法，优选地，用于过继性t细胞疗法或tcr基因疗法。
85.一种小鼠，其包含编码完整未重排的人tcr α和β基因座的核酸，并在其cd4+ t细胞上表达源自所述基因座的重排tcr，还表达融合至小鼠i-e的非-抗原-结合结构域的人hla-dr4，其中所述小鼠缺乏小鼠tcr和小鼠mhc ii类分子。
实施例
86.实施例1
ꢀ–
在ababdii小鼠中对ny-eso-1
157-165
特异性的hla-a02-限制的人tcr的产生如在li et al. (2010, nature medicine 16, 1029-1034)中所述产生ababdii小鼠。对ny-eso-1
157-165
特异性的大量cd8+群从接种疫苗的小鼠分离并按照在linnemann et al. (2013, nature medicine 19, 1534-1541)中公开的方案，通过tcr基因捕获分析。
87.产生如表2中所示的和通过根据seq id no:18和19的cdr3序列表征的tcr-eso。
88.用于全长构建体的最佳序列在seq id no: 106/107和seq id no: 110/111中提供。seq id no: 112对应于下文所用的单链核酸构建体。
89.实施例2
ꢀ–ꢀ
hla-a02-限制的人tcr的功能分析得自ababdii小鼠的ny-eso
157-165-特异性tcr-eso，如实施例1中生成的，与黑素瘤患者-衍生的tcr 1g4比较(chen, et al., 2005, j. exp. med. 201, 1243
–
55)。两种tcr识别表位157-165 (seq id no: 103)。tcr在来自人供体的pbmc的人t细胞中表达(图1a)。用ababdii-衍生的tcr-eso转导的t细胞证实增加的抗原敏感性并在识别肽-荷载的t2细胞时诱导比用人-衍生的tcr 1g4转导的t细胞更高的最大ifnγ水平(图1b)。此外，tcr-eso-转导的人t细胞在与表达hla-a2
+
癌细胞的ny-eso共同培养后产生比1g4-转导的t细胞更多的ifnγ (图1c)。
90.与从人供体分离的tcr比较，得自ababdii小鼠的tcr令人吃惊地显示卓越的功能活性。
91.实施例3
ꢀ–
在ababdr4小鼠中对ny-eso-1
116-135
特异性的hla-dr4-限制的人tcr的产生针对ny-eso-1的hla-dr4-限制的tcr在人tcr基因座/hla-dra-ie/hla-drb1*0401-ie转基因(ababdr4)小鼠中饲养(图2)。这些小鼠通过使hla-dra-ie/hla-drb1*0401-ie转基因小鼠(ito et al., 1996, j exp med 183(6): 2635-2644)与人tcr基因座转基因小鼠(li et al., 2010, nat. medicine 16(9):1029-1034)杂交来生成。这个模型的优点是在ababdr4小鼠中的t细胞表达多样化的人tcr库，但不能经受对在其中人和小鼠序列彼此不同的区域中的人肿瘤抗原的耐受机制。本发明人发现用ny-eso-1免疫ababdr4小鼠导致在人类中不能发现的高亲和力tcr的生成。由于hla-dr4-ie作为独有的mhc ii类限制分子，免疫ababdr4小鼠生成识别具有hla-dr4限制的免疫抗原的cd4+ t细胞。
92.在用ny-eso-1
116-135
肽或全长ny-eso-1 dna接种后，从ababdr4小鼠生成对与hla-dr4组合的ny-eso-1
116-135
肽有特异性的tcr。对ny-eso-1
116-135
特异性的大量cd4+群被分离和tcr链通过cdna末端的5’快速扩增来提取。图3显示来自用抗-cd3/cd28 dynabead、不相关的肽或ny-eso
116-135
再刺激过夜的ababdr4小鼠的外周血白细胞的特异性活性，如通过
ifnγ的生产所证明的。
93.生成通过根据seq id no:1和10、2和11、3和12、4和13、5和14、6和15、7和16、8和17和9和18的cdr3序列表征的tcr，如表1中所示。本发明因此提供对于ny-eso-1的第一个hla-dr4限制的人tcr。
94.用于全长构建体的最优序列在seq id no: 40-48/49-57和seq id no: 76-84/85-93中提供。seq id no: 94-102对应于用于以下实验的单链核酸构建体。
95.实施例4
ꢀ–
hla-dr4-限制的人tcr的功能分析为证实分离的tcr赋予对相关肽/mhc复合体的特异性结合，tcr-缺乏和表达cd4的jurkat细胞用如在实施例3中制备的ny-eso-1-反应性tcr转导，并用ny-eso-1
116-135
/dr4-四聚体(ny-eso-1 tet)或clip/dr4-四聚体(clip tet)作为对照染色(tcr3598、tcr3600和tcr5412的数据在图5中显示)。特异性被证实。
96.分离的tcr也赋予针对表达ny-eso-1的细胞的功能活性。这被与天然表达hla-dr4和/或ny-eso-1和对ifnγ细胞内染色的不同黑素瘤细胞系共同培养的来自人pbmc的tcr-转导的或非-转导(对照) cd4+ t细胞证明(tcr3598、tcr3600和tcr5412的数据在图6中显示)。
97.tcr5412的转移导致ifn-γ cd4+细胞的更高比例。因此，包含seq id no:3和12的cdr3序列的tcr构建体在本发明的情况中是特别优选的。
98.实施例5
ꢀ–
对ny-eso-1表位特异性的cd4+和cd8+ t细胞的组合的过继性t细胞转移对ny-eso-1特异性的mhc i和mhc ii限制的tcr的组合应用在癌症的过继性t细胞疗法的小鼠模型中进行试验。ny-eso-1和hla-a2阳性肿瘤细胞系在hla-dr4-iexrag-/-小鼠中移植，并用mhc i-限制的tcr转导的鼠cd8 t细胞或者用mhc ii-限制的tcr转导的鼠cd4 t细胞或者二者的混合物治疗。随时间的推移监测接受者小鼠的肿瘤排斥反应和复发。对于用mhc i和mhc ii限制的tcr二者治疗，期望没有复发。