一种稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法及其应用

本发明涉及稻粒黑粉病病原菌，尤其涉及一种稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法及其应用。

背景技术：

1、稻粒黑粉病是杂交水稻制种中的第一大病害，该病害轻发年份水稻制种产量减产一般在5％-10％，而病害严重的年份可导致减产达30％-60％。杂交水稻制种过程中花期、灌浆期遇上阴雨天气则后期稻粒黑粉病发病就严重。根据我国气候特点，杂交水稻制种过程花期、灌浆期遇上阴雨天气的概率很大，严重病害的发生概率很高；因此，稻粒黑粉病的防控工作变得非常重要。对病原菌的检测是稻粒黑粉病防控的重要环节，简便的检测技术可以广泛应用到杂交水稻制种过程的各个环节中便于病害防控。

2、一般认为，水稻稻粒黑粉病是由狼尾草腥黑粉菌(tilletia barclayana(bref.)sacc&syd.)引起的。但是本技术发明人发现了引起稻粒黑粉病的一种新的病原菌——南极莫氏黑粉菌moesziomyces antarcticus；并且经过连续4年的取样调查证明，南极莫氏黑粉菌是近几年水稻稻粒黑粉病的主要病原菌。至今，对南极莫氏黑粉菌的研究集中在糖醇脂类代谢物的开发利用，而并没有其对水稻致病的报道。对于该菌，至今无特异性鉴定方法，一般用常规的微生物分子鉴定方法，比如通过pcr扩增its、18s和16s等保守序列并测序比对后才能判断，比较费钱费时费力。因此，我们开发了本发明技术，即稻粒黑粉病新病原菌南极莫氏黑粉菌的特异性鉴定方法，以便用于由南极莫氏黑粉菌引起的稻粒黑粉病方面的病害检测。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、鉴于以上所述新发现及现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法及其应用，在有复杂微生物背景的样品中(包括种子、植株、生物组织和土样等等)大程度排除非目标菌的干扰、富集并快速检测出有无稻粒黑粉病的新病原菌。

3、(二)技术方案

4、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括用于对稻粒黑粉病新病原菌进行特异性鉴定的专用引物，是由下列引物对组成：

5、mauns-f:tcaagagcctttgtcctcgg；

6、mauns-r:atgtcgtggcgagcatcgt。

7、较佳地，专用引物在对稻粒黑粉病新病原菌进行特异性鉴定中的应用。

8、另一方面，本发明公开一种稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法，包括如下步骤：

9、(1)根据南极莫氏黑粉菌，通过生物学分析得到具有特异性的序列 seq id no:1；

10、(2)在序列seq id no:1内选合适区段设计特异性引物，其中包括所述特异性引物为：

11、mauns-f:tcaagagcctttgtcctcgg；

12、mauns-r:atgtcgtggcgagcatcgt；

13、但不限于该引物对。

14、(3)对待检测样品进行处理，得到待检测样品中的dna，以待检测样品的dna为模板，用步骤(2)的引物进行pcr扩增，通过分析pcr扩增产物中有无南极莫氏黑粉菌moesziomyces antarcticus特异性片段来确定待检测样品中是否有目的病原菌南极莫氏黑粉菌moesziomyces antarcticus。

15、较佳地，步骤(3)中，所述的待检测的样品包括菌落、菌液、种子、植株、生物组织或土样。

16、较佳地，步骤(3)对所述的待测样品进行处理包括富集，富集方法包括如下步骤:

17、将待检测样品放入无菌水中研磨，混匀后吸取混合液涂布到固体培养基hfj，在25℃-30℃恒温培养箱中静置培养24-72h，待长出菌落即可进行下一步实验；

18、或将待检测样品放入无菌水中研磨，吸取混合液加入液体培养基 hfjy中，然后在摇床中25℃-30℃，150-220rpm转速下培养24-72h，得到菌液即可进行下一步实验；

19、所述培养基hfj成分中不含任何氮源，按质量百分比含：碳源0.4％ -1％、碳酸钙0.2％-0.6％、硫酸镁0.01-0.05％、磷酸二氢钾 0.01-0.03％、琼脂粉1.2-2％，ph值6.5-7.0；该培养基中还含有能抑制细菌而不抑制真菌的抗生素；所述碳源为蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇中的一种或几种；

20、所述培养基hfjy成分中不含任何氮源，按质量百分比含：碳源0.4％ -1％、碳酸钙0.2％-0.6％、硫酸镁0.01-0.05％、磷酸二氢钾 0.01-0.03％，ph值6.5-7.0；该培养基中还含有能抑制细菌而不抑制真菌的抗生素；所述碳源为蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇中的一种或几种。

21、较佳地，所述的待检测样品和无菌水质量比为1：1-4。

22、较佳地，对于固体培养基hfj的培养物，刮取混合菌落制备dna模板或挑取单菌落制备dna模板；

23、对于液体培养基hfjy培养的菌液，采用菌液或离心浓缩后的菌体制备dna模板。

24、较佳地，dna模板快速制备方法包括如下步骤：

25、将菌体或菌液与koh溶液混合，将得到的混合液在沸水浴中放置 10-20分钟后离心收集菌体。

26、较佳地，所述的混合液中koh浓度为0.1m-0.5m。

27、(三)有益效果

28、本发明的有益效果是：本发明是在发明人发现近几年稻粒黑粉病的主要病原菌是一种新的病原黑粉菌moesziomyces antarcticus所引起的基础上，开发了针对病原菌moesziomyces antarcticus的特异性序列seq id no:1的高效特异性检测方法。本发明的富集步骤进一步提高对复杂微生物背景的样品中目的菌种的检测灵敏性，可排除90％以上其他杂菌并增加目的菌种的菌体数量。在高效的dna模板快速制备条件下，该特异性片段的pcr效率高，在20μl反应体系中的检出最小拷贝数在100个左右，达到生产应用的范畴。本发明可用于检疫、稻粒黑粉病预警和防控以及相关研究中。

29、本发明可以专一性的扩增出稻粒黑粉病新病原菌moesziomyces antarcticus特异性条带，为稻粒黑粉病提供了准确的检测技术；省去了常规菌种鉴定所必须的测序和序列对比分析两个步骤，节约检测成本90％以上(按dna测序市场价15元/样成本算)，减少了测序时间和序列对比分析等时间和人工成本。结合目的菌富集排除了含有复杂微生物背景的样品(如种子、植株、生物组织和土样等)中90％以上的杂菌，富集步骤对目标菌的灵敏度提高90％以上。另外，dna模板快速制备步骤进一步缩减整个检测流程的时间和dna提取成本。

技术特征：

1.一种用于对稻粒黑粉病新病原菌进行特异性鉴定的专用引物，其特征在于，是由下列引物对组成：

2.由权利要求1所述的专用引物在对稻粒黑粉病新病原菌进行特异性鉴定中的应用。

3.一种稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.如权利要求3所述的稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法，特征在于，步骤(3)中，所述的待检测的样品包括菌落、菌液、种子、植株、生物组织或土样。

5.如权利要求3所述的稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法，其特征在于，步骤(3)对所述的待测样品进行处理包括富集，富集方法包括如下步骤:

6.如权利要求5所述的稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法，其特征在于，所述的待检测样品和无菌水质量比为1：1-4。

7.如权利要求5所述的稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法，其特征在于，

8.如权利要求7所述的稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法，其特征在于，dna模板快速制备方法包括如下步骤：

9.如权利要求8所述的稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法，其特征在于，所述的混合液中koh浓度为0.1m-0.5m。

技术总结
本发明公开一种稻粒黑粉病新病原菌的特异性鉴定方法及其应用，该鉴定方法，包括根据南极莫氏黑粉菌得到具有特异性的序列；设计一组特异性引物；对待检测样品进行处理，得到待检测样品中的DNA，以待检测样品的DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，通过分析PCR扩增产物中有无南极莫氏黑粉菌Moesziomyces antarcticus特异性片段来确定待检测样品中是否有目的病原菌南极莫氏黑粉菌Moesziomyces antarcticus。本发明为稻粒黑粉病提供了准确的检测技术，减少了测序费用、测序时间和序列对比分析等资金、时间和人工成本。结合目的菌富集排除了含有复杂微生物背景的样品中90％以上的杂菌，富集步骤对目标菌的灵敏度提高90％以上。

技术研发人员：李智敏,程毅,陈佳,高春生,郭利桃,王吐虹
受保护的技术使用者：中国农业科学院麻类研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15