一种快速构建sandwichELISA的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种快速构建sandwich elisa的方法。

背景技术：

1、酶联免疫吸附实验(elisa)是一种特殊的酶免疫测定(eia)类型，可使用抗体定量某种目标分子。抗体用于特异性检测分析物(例如肽、蛋白、抗体、小分子)。酶(例如辣根过氧化物酶，hrp)直接或间接偶联该抗体，从而提供检测方法并可能扩增信号。目标分子可以是会导致动物免疫系统发起防御反应的毒素或其他外来物质，例如流感病毒或环境污染物。潜在抗原的范围很广，因此在许多研究和检测领域中使用elisa来检测和定量各种样本类型中的抗原。使用elisa分析细胞裂解物、血样、食品等特定物质，在科学研究，医学诊断以及食品卫生和环境安全监测中使用广泛。

2、目前酶联吸附试验分为：直接elisa，间接elisa,竞争性elisa以及sandwichelisa。目前，sandwich elisa的灵敏度以及特异性优于其他类型的elisa。sandwich elisa俗称“三明治”elisa，利用包被在板子上的捕获抗体捕获目的抗原，再利用检测抗体识别抗原，可以在样本中定量检测目标分子。目前sandwich elisa中，可以用单克隆抗体以及多克隆抗体相互组合。鉴于多克隆抗体中成分多样，产生较高的非特异性信号，sandwich elisa更倾向于使用两种单克隆抗体。

3、sandwich elisa开发过程中的核心技术在于开发两种可以互相组合的单克隆抗体。目前常规开发方案是利用杂交瘤技术研发多种目标分子相关的单克隆抗体，然后一一组合，测试组合后检测的特异性和灵敏度。此过程可能由于抗体识别结构域重叠，蛋白间位阻效应的影响，导致elisa的开发失败。除此之外从动物免疫，融合及细胞株筛选，抗体组合测试，整个流程所用的时间以及经济成本耗费巨大。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速构建sandwichelisa的方法，能够有效避免由于两种抗体识别结构域的重叠以及蛋白间位阻效应的干扰等因素导致构建费时费力的问题。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明公开了一种快速构建sandwich elisa的方法，包括：通过免疫共沉淀法，在已知抗原的多克隆抗体中，筛选出能够与已知目的抗原的单克隆抗体形成免疫酶联吸附实验双抗夹心配对的抗体序列，再利用原核表达或蛋白合成的方法，获得目的抗体即完成sandwich elisa的快速构建。

4、优选地，所述的快速构建sandwich elisa的方法，包括以下步骤：

5、1)将生物素标记的单克隆抗体与抗原孵育过夜，形成稳定的抗体抗原复合物；

6、2)将待筛选的多克隆抗体加入步骤1)得到的抗体抗原复合物中，继续孵育，形成类似“三明治”结构的复合物；

7、3)将链霉素标记的固体介质加入步骤2)的反应体系中，继续孵育，通过离心将类似“三明治”结构的复合物分离，得到能够与单克隆抗体共同结合抗原的抗体，测序、再通过表达及纯化，获得目的抗体。

8、进一步优选地，步骤1)中，单克隆抗体与抗原的摩尔比为1:1。

9、进一步优选地，所用生物素标记的单克隆抗体的摩尔浓度大于多克隆抗体的摩尔浓度。

10、进一步优选地，步骤3)中，所述固体介质采用凝胶颗粒。

11、更进一步优选地，凝胶颗粒在使用前采用1％～3％的牛血清白蛋白进行封闭处理。

12、更近一步优选地，1％～3％的牛血清白蛋是将0.1～0.3mg的bsa粉末加到10ml的pbs-t溶液中配制而成。

13、更进一步优选地，步骤3)中，测序具体操作如下：

14、首先清洗凝胶颗粒，利用氨水洗脱凝胶颗粒上的阳性抗体，将洗脱后的液体冻干，通过凝胶电泳将含有目的条带的胶条回收，进行质谱测序，得到目的抗体的轻链可变区序列。

15、更进一步优选地，采用ph值为7.4的150mm的磷酸氢铵清洗凝胶颗粒，采用150mm的氨水洗脱凝胶颗粒上的阳性抗体。

16、进一步优选地，步骤3)中，表达及纯化具体操作如下：

17、将测序得到的序列利用基因合成的方法，克隆至质粒载体中，同时在序列的n段加上his标签，将合成后的质粒转化至大肠杆菌表达菌中，利用iptg诱导，诱导后的菌液经破碎处理后得到总蛋白，利用his标签的纯化法纯化得到目的蛋白。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、本发明公开的方法利用免疫共沉淀原理，利用已知的单克隆抗体结合目的抗原，在多克隆抗体中直接筛选以及获得目的抗体序列，整个过程模拟sandwich elisa抗体抗原的结合，直接在多抗阶段进行两种抗体的互相配对，避免由于两种抗体识别结构域的重叠以及蛋白间位阻效应的干扰等因素，因此节省了开发单抗需要耗费的时间与经济成本，能够省时省力的快速开发sandwich elisa以及相应的试剂盒。具体优点体现在：

20、第一，本发明可以节省开发sandwich elisa时间成本，在目的抗原已有单抗和多抗的情况下，直接利用免疫沉淀的方法进行抗体组合，筛选得到合适的抗体组合，前后开发大约2-3个月；

21、第二，本发明可以节省开发sandwich elisa的抗原成本，针对稀有蛋白的sandwich elisa开发，最大的瓶颈在于缺少目的蛋白，给抗体开发造成了难度，本发明只需要利用约100ug的抗原就可以开发出sandwich elisa；

22、第三，本发明可以节省开发sandwich elisa的经济成本，常规方法的开发，需要耗费大量的经济成本用于抗体开发，但本发明无论是过程中使用的抗原还是抗体，用量均低；除此之外，质谱测序，基因合成以及原核表达都是常规的实验操作，经济成本均低。

23、进一步地，利用标记好的凝胶颗粒或者其他固体介质从溶液中将双抗以及抗原的夹心复合物分离。

24、进一步地，利用浓度不等的bsa溶液封闭和pbst溶液清洗减少免疫共沉淀中产生的非特异吸附。

25、进一步地，利用氨水洗脱结合的抗体抗原复合物，方便后期直接冻干测序，同时避免大量破坏生物素与链霉素的结合。

技术特征：

1.一种快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，包括：通过免疫共沉淀法，在已知抗原的多克隆抗体中，筛选出能够与已知目的抗原的单克隆抗体形成免疫酶联吸附实验双抗夹心配对的抗体序列，再利用原核表达或蛋白合成的方法，获得目的抗体即完成sandwich elisa的快速构建。

2.根据权利要求1所述的快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，步骤1)中，单克隆抗体与抗原的摩尔比为1:1。

4.根据权利要求2所述的快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，所用生物素标记的单克隆抗体的摩尔浓度大于多克隆抗体的摩尔浓度。

5.根据权利要求2所述的快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，步骤3)中，所述固体介质采用凝胶颗粒。

6.根据权利要求5所述的快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，凝胶颗粒在使用前采用1％～3％的牛血清白蛋白进行封闭处理。

7.根据权利要求5所述的快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，步骤3)中，测序具体操作如下：

8.根据权利要求7所述的快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，采用ph值为7.4的150mm的磷酸氢铵清洗凝胶颗粒，采用150mm的氨水洗脱凝胶颗粒上的阳性抗体。

9.根据权利要求2所述的快速构建sandwich elisa的方法，其特征在于，步骤3)中，表达及纯化具体操作如下：

技术总结
本发明公开了一种快速构建sandwich ELISA的方法，属于生物技术领域，本发明利用免疫共沉淀原理，利用已知的单克隆抗体结合目的抗原，在多克隆抗体中直接筛选以及获得目的抗体序列，整个过程模拟sandwich ELISA抗体抗原的结合，避免由于两种抗体识别结构域的重叠以及蛋白间位阻效应的干扰等因素，省时省力快速开发sandwich ELISA以及相应的试剂盒。

技术研发人员：陈平,洪伟,陈爽
受保护的技术使用者：深圳先进技术研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13