重组乳酸脱氢酶及其制备方法和应用与流程

本发明及生物，特别涉及重组乳酸脱氢酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,ldh)是一种四聚酶，属于2-羟基酸氧化还原酶家族，它能催化底物丙酮酸和乳酸之间的可逆反应，同时需要还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)作为辅因子。编码ldh有四个基因：ldha,ldhb,ldhc和ldhd，ldha被称为m亚基，主要存在于骨骼肌中，ldhb被称为h亚基，主要存在于心脏中。亚基分子量约为35kda。两种亚基之间可以进行同型或异型重组，因此产生了5种ldh的同工酶：ldh-1(4h)、ldh-2(3h，1m)、ldh-3(2h，2m)、ldh-4(1h，3m)、ldh-5(4m)。乳酸脱氢酶普遍存在于肝脏、肾脏、心肌、骨骼肌和红细胞中，在不同的病理条件下，乳酸脱氢酶会从受损的组织渗入血清，造成血清中乳酸脱氢酶的含量明显升高，因此乳酸脱氢酶在各种常见病和罕见病的临床诊断中起着关键作用。同时乳酸脱氢酶在生物制化工领域可用于苯乳酸等产品制备，在食品领域可作为食品添加剂用于发酵奶制品的生产，也是丙氨酸氨基转移酶试剂盒等体外诊断试剂的主要原料，因此开发具有活性的乳酸脱氢酶具有重要的实践意义和应用前景。

2、尽管乳酸脱氢酶是一种生化和临床常用的诊断用酶，需求量巨大，但是目前中国仍然需要进口。商品化的乳酸脱氢酶主要来源于动物组织，但是动物组织中酶系复杂，提取酶的活性易受来源、提取方法等因素的影响。提取工艺复杂，存在效率低、纯度低、纯化成本高等问题，不利于实现稳定的工业生产。因此，寻找一种产物稳定性好，易于纯化、易于转发酵批量生产的乳酸脱氢酶方法至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种乳酸脱氢酶的制备方法，使得制备乳酸脱氢酶稳定性好，产率更高，易于纯化、易于转发酵批量生产，成本更低。

2、为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种编码乳酸脱氢酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

3、(i)具有如seq id no.1所示序列的多核苷酸；

4、(ii)具有与如seq id no.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

5、(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

6、本发明第二方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的的多核苷酸。

7、在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达his×6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的3’端连接有表达his×6标签的多核苷酸序列。

8、在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pet-28a(+)。

9、本发明第三方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

10、所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的的多核苷酸。

11、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)。

12、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌rosetta(de3)菌株。

13、本发明第四方面提供了一种制备乳酸脱氢酶的方法，所述方法包括步骤：

14、培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

15、分离所述目的蛋白，即得所述乳酸脱氢酶；

16、其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如seq id no:2所示的氨基酸序列。

17、在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。

18、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。

19、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用iptg进行诱导，以表达出目的蛋白。

20、本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者

21、如本发明第二方面提供的表达载体；或者

22、如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者

23、或者根据本发明第四方面所述的方法制备的乳酸脱氢酶。

24、本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

25、(1)本发明提供的方法，通过密码子优化序列，利用大肠杆菌表达系统成功表达出乳酸脱氢酶，该方法产量高，生长周期短，产物稳定性好；

26、(2)本发明提供的方法采用了基因工程大肠杆菌重组融合表达乳酸脱氢酶，并实现了在大肠杆菌系统的可溶性表达蛋白的产量高，易于纯化，并具备催化活性，易于转发酵批量生产。

27、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

技术特征：

1.一种编码乳酸脱氢酶的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括表达his×6标签的多核苷酸序列。优选地，所述表达载体中，如权利要求1所述的多核苷酸的3’端连接有表达his×6标签的多核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pet-28a(+)。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2至4中任一项所述的表达载体；或者

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

7.一种制备乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，通过iptg诱导以表达出目的蛋白。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸；或者

技术总结
本申请公开了一种重组乳酸脱氢酶及其制备方法和应用。本申请中，编码所述乳酸脱氢酶的多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。所用多核苷酸十分适配大肠杆菌表达系统，制备的乳酸脱氢酶产量高，产物稳定性好，可溶性乳酸脱氢酶含量高，易于纯化和发酵批量生产。

技术研发人员：刘霭珊,蒋析文,朱伟伟,张伟,王周全
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13