腺病毒表达载体及生产方法和细胞系与流程

本申请一般的涉及腺病毒载体和基因治疗，更具体地说，涉及不可复制的腺病毒表达载体、合成方法和复制方式。

背景技术：

1、腺病毒载体的核苷酸序列通常有许多千碱基长，这使得体外操作不那么方便，也难以实现。对腺病毒载体的操作，如果操作不当，也会导致载体的无节制复制。此外，用于生产腺病毒的普通哺乳动物细胞系往往拥有腺病毒基因的内源拷贝，它们可以与突变的腺病毒载体重组，产生具有感染性的复制病毒。因此，存在对安全的、非感染性的、重组的、不可复制的、具有有效表达盒的腺病毒载体的需求，用于治疗用途。还希望提供一种在细菌中更有效地生产这些重组载体的方案，克服操作大型腺病毒序列的困难。最后，进一步希望能提供一种用于复制工程化的腺病毒载体的哺乳动物细胞系，以消除能复制的腺病毒可能带来的污染。

技术实现思路

1、本公开提供了一种腺病毒载体，它具有：a)使其不能复制的一种或多种突变，和b)携带核苷酸表达盒，当转导到宿主细胞时允许表达治疗剂。本文公开了工程化的腺病毒载体的序列。本文还提供了在细菌中更有效地生产合成的腺病毒载体的方案和方法。最后，本文产生了用于复制工程化的腺病毒载体的工程化的哺乳动物细胞系，以消除能复制的腺病毒的可能污染。

2、不可复制的腺病毒表达载体可以包括：a)使腺病毒不能复制的一种或多种突变，和b)编码蛋白质或rna的至少一个核苷酸序列。在一些实施方案中，该载体包括与seq idno：1-2中任何一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。seq id no：1编码带有质粒骨架的完整载体。seq id no：2编码本公开的不含质粒骨架的完整腺病毒载体。在某些优选的实施方案中，该载体是腺病毒血清型5载体。突变可以包括e1基因或e3基因或两者的缺失。不可复制的腺病毒表达载体中的至少一个核苷酸序列可以是转基因。在某些实施方案中，该转基因表达人il10。在一些实施方案中，该转基因进一步包括包含cag的增强子/启动子区域、人il10 cdna、或多腺苷酸化信号、或其任意组合中的至少一个。多腺苷酸化信号进一步可以是sv40区域和/或完整polya信号。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号可以插入seqid no：3的核苷酸440和3515之间。seq id no：3可以来源于genbank数据库中的登录号ay3339865。

3、转基因在腺病毒载体中的插入可以取代e1基因，但使pix基因保持完整。在本公开的一些方面，重组载体可以包括与seq id no：1-2具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于99％序列同一性的核酸序列。

4、本文还公开了一种合成腺病毒载体的方法。该方法可以包括：a)产生多个重叠的腺病毒子片段，每个子片段包括腺病毒全基因组的一部分；b)将子片段环化以形成质粒结构；c)将环化的子片段组装成线性结构，其中该载体包括两个或更多个子片段的组合。在该方法的一些方面，腺病毒载体可以是腺病毒血清型5。在某些实施方案中，该载体可以高效率地复制。

5、第一子片段可以包括至少一个如seq id no：4-5所述的序列。在一些实施方案中，第二子片段可以包括至少一个如seq id no：6-7所述的序列。

6、在一些实施方案中，每个子片段可以包括约50％的腺病毒全基因组。至少一个片段可以包括表达人il-10的转基因。该转基因进一步可以包括增强子/启动子区域、人il10cdna、或多腺苷酸化信号、或其任意组合中的至少一个。该增强子或启动子区域可以是cag启动子。该转基因进一步可以包括至少一个包含sv40启动子或完整poly(a)信号的多腺苷酸化信号。载体序列还可以具有线性克隆载体和或骨架线性克隆载体。在某些实施方案中，线性克隆载体可以是pjazz-ok。人il10的cdna序列可以由seq id no：8优化和编码。

7、本文还提供了一种哺乳动物细胞，其被配置以复制腺病毒载体其中细胞系包括表达e1a和e1b基因产物的核苷酸序列，但不含其他腺病毒序列。该细胞系进一步可以包括经工程化以表达e1a和e1b基因产物的慢病毒载体，其中当突变的腺病毒载体被引入该细胞系时，该慢病毒载体抑制功能性腺病毒的重构。在一些实施方案中，该细胞系可以包括hela细胞。在一些实施方案中，该细胞系是通过用至少包括e1a编码序列和e1b编码序列的慢病毒基因组质粒转染hek293细胞而产生的。

8、该质粒进一步可以至少包括e1a编码序列和e1b编码序列，包含e1a和e1b序列，该e1a和e1b序列排列在具有双向启动子的双向表达单元中，以防止与突变的腺病毒载体重组。在该细胞系的一些方面，双向启动子可以是截短的cmv和pgk启动子的组合。

9、该细胞系进一步可以在慢病毒基因组序列中包括嘌呤霉素耐药基因，以便在表达嘌呤霉素耐药基因时区分整合有慢病毒序列的细胞。在一些实施方案中，使用seq id no：9的最终载体来产生慢病毒，转导hela细胞并选择嘌呤霉素抗性。

10、本文还提供了一种生产和/或扩增上述公开的合成的不可复制的腺病毒载体的方法。该方法可以包括：用腺病毒载体转化哺乳动物细胞，所述腺病毒载体包括a)使腺病毒不能复制的一种或多种突变，和b)编码人il-10的至少一个核苷酸序列，其中该哺乳动物细胞包括表达e1a和e1b基因产物的核苷酸序列，但不含其他腺病毒序列；在含有插入的慢病毒e1a和e1b载体的细胞系中培养转化的哺乳动物细胞；和分离腺病毒载体。

11、在本公开的另一个方面，本文还提供了一种治疗需要基因产物的受试者的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括以下、基本上由以下组成或进一步由以下组成：向受试者施用包含(a)使腺病毒不能复制的一种或多种突变和(b)编码基因产物的至少一个核苷酸序列的载体。在该方法的一些实施方案中，该载体包括在seq id no：2或seq id no：2的整个序列上具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列。在某些实施方案中，该载体可以是腺病毒血清型5载体。另外地或替代地，该一种或多种突变可以是e1基因或e3基因或两者的缺失。该至少一个核苷酸序列进一步可以包括转基因。在一些实施方案中，该转基因表达人il10。

12、在该方法的一些实施方案中，受试者可以是人。在某些实施方案中，基因产物是肽，包括人类肽。在某些实施方案中，基因产物可以是rna。

技术特征：

1.一种不可复制的腺病毒表达载体，其包括：a)使腺病毒不能复制的一种或多种突变，和b)编码基因产物的至少一个核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体包括在seq id no：1或seq id no：2的整个序列上具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列。

3.根据权利要求2所述的载体，其中所述载体包括与seq id no：1-2具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于99％序列同一性的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体包括腺病毒血清型5载体。

5.根据权利要求1所述的载体，其中所述一种或多种突变包括e1基因或e3基因或两者的缺失。

6.根据权利要求1所述的载体，其中所述至少一个核苷酸序列包括转基因。

7.根据权利要求6所述的载体，其中所述转基因表达人il10。

8.根据权利要求6所述的载体，其中所述转基因进一步包括包含cag区域的增强子/启动子区域、人il10cdna、或多腺苷酸化信号、或其任意组合中的至少一个。

9.根据权利要求8所述的载体，其中所述多腺苷酸化信号包括sv40区域和/或完整polya信号。

10.根据权利要求8所述的载体，其中所述多腺苷酸化信号首先插入seq id no：3的核苷酸440和3515之间。

11.根据权利要求8所述的载体，其中转基因的插入取代了e1基因，但使pix基因保持完整。

12.一种合成腺病毒载体的方法，其包括：

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述腺病毒载体包括腺病毒血清型5。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述载体在细菌中的复制效率高。

15.根据权利要求12所述的方法，其中第一子片段包括从seq id no：4的3’端或从seqid no：5的5’端所述的序列。

16.根据权利要求12所述的方法，其中第二子片段包括从seq id no：6的3’端或seq idno：7中的5’端所述的序列。

17.根据权利要求12所述的方法，其中第二子片段的右端由seq id no：11编码。

18.根据权利要求12所述的方法，其中第二子片段的左端由seq id no：12编码。

19.根据权利要求12所述的方法，其中第二子片段的3′端由seq id no：13编码。

20.权利要求12所述的方法，其中每个子片段包括约50％的腺病毒全基因组。

21.根据权利要求20所述的方法，其中至少一个片段包括表达人il-10的转基因。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述转基因进一步包括增强子或启动子区域、人il10 cdna基因、或多腺苷酸化信号、或其任意组合中的至少一个。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述增强子/启动子区域包括cag启动子。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述转基因至少包括包含sv40启动子或完整poly(a)信号的多腺苷酸化信号。

25.根据权利要求12所述的方法，其中所述载体序列包括线性克隆载体骨架，所述线性克隆载体骨架在腺病毒载体的最终合成中被移除。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述人il10的cdna序列是由seq id no：8优化和编码的。

27.一种被配置以复制腺病毒载体的哺乳动物细胞系，其中所述细胞系包括表达e1a和e1b基因产物的核苷酸序列，但不含其他腺病毒序列。

28.根据权利要求24所述的细胞系，进一步包括经工程化以表达e1a和e1b基因产物的慢病毒载体，其中当突变的腺病毒载体被引入细胞系时，所述慢病毒载体抑制功能性腺病毒的重构。

29.根据权利要求25所述的细胞系，其中所述细胞系包括hela细胞。

30.根据权利要求28所述的细胞系，其中所述细胞系是通过用至少包括e1a编码序列和e1b编码序列的慢病毒基因组质粒转染hek293细胞而产生的。

31.根据权利要求27所述的细胞系，其中至少包含e1a编码序列和e1b编码序列的质粒含有e1a和e1b序列，所述e1a和e1b序列排列在具有双向启动子的双向表达单元中，以防止与突变的腺病毒载体重组。

32.根据权利要求28所述的细胞系，其中所述双向启动子是截短的cmv和pgk启动子的组合。

33.根据权利要求27所述的细胞系，进一步包括慢病毒基因组序列中的嘌呤霉素耐药基因，以便在表达嘌呤霉素耐药基因时区分整合有慢病毒序列的细胞。

34.根据权利要求27所述的细胞系，其中使用seq id no：9编码的最终载体来生产慢病毒，转导hela细胞并选择嘌呤霉素抗性。

35.一种生产如权利要求1所述的载体的方法，所述方法包括：用腺病毒载体转化哺乳动物细胞，所述腺病毒载体包括a)使腺病毒不能复制的一种或多种突变，和b)编码转基因的至少一个核苷酸序列，其中所述哺乳动物细胞包括表达e1a和e1b基因产物的核苷酸序列，但不含其他腺病毒序列；在含有插入的慢病毒e1a和e1b载体的细胞系中培养转化的哺乳动物细胞；和分离所述腺病毒载体。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述转基因表达人il-10。

37.一种治疗需要基因产物的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用载体，所述载体包括(a)使腺病毒不能复制的一种或多种突变和(b)编码所述基因产物的至少一个核苷酸序列。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述载体包括在seq id no：1或seq id no：2的整个序列上具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述载体包括腺病毒血清型5载体。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述一种或多种突变包括e1基因或e3基因或两者的缺失。

41.根据权利要求37所述的方法，其中所述至少一个核苷酸序列包括转基因。

42.根据权利要求42所述的方法，其中所述转基因表达人il10。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者是人类。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述基因产物是肽。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述肽是人类肽。

46.根据权利要求42所述的方法，其中所述基因产物是rna。

技术总结
提供了一种腺病毒表达载体。该腺病毒表达载体可以包括：a)使腺病毒不能复制的一种或多种突变；b)编码蛋白质或RNA的至少一个核苷酸序列。还提供了一种合成腺病毒载体的方法。该合成方法可以包括：a)产生多个重叠的腺病毒子片段，每个子片段包括腺病毒全基因组的一部分；b)将子片段环化以形成质粒结构；和c)将环化的子片段组装成线性结构，其中该载体包括两个或更多个子片段的组合。还提供了一种被配置以复制腺病毒载体的哺乳动物细胞系，其中该细胞系包括表达E1A和E1B基因产物的核苷酸序列，但不含其他腺病毒序列。

技术研发人员：C·埃克斯莱恩,H·刘,S·史蒂文斯
受保护的技术使用者：朗格生物技术公共公益股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12