具有双重突变的人干扰素β变体和用于改善人干扰素β变体的稳定性的方法与流程

本申请要求于2020年4月29日提交的韩国专利申请号10-2020-0052513和10-2020-0052913的优先权，所述专利申请的全部内容是本申请的参考。本发明涉及具有双重突变的人干扰素β变体和用于改善人干扰素β变体的稳定性的方法，并且更具体而言，涉及包括具有丝氨酸取代人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列的人干扰素β变体、以及用于改善人干扰素βr27t变体的稳定性的方法，该方法包括用丝氨酸取代人干扰素βr27t变体中的第17个氨基酸丝氨酸的步骤，在所述人干扰素βr27t变体中，用苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

背景技术：

1、干扰素(ifn)是一类细胞因子，并且具有抗病毒活性且具有抑制细胞增殖和调控天然免疫应答的功能，并且在其中，干扰素β(ifn-β)是具有五个α螺旋的球状蛋白质，其大小为22kd，并且当去除糖链后，变成18kd(arduini等，protein science 8：第1867-1877页，1999)。

2、关于干扰素β的临床应用的研究正在积极进行中，并且特别地，干扰素β作为用于缓解、减轻或治疗多发性硬化的症状的药物备受关注。

3、干扰素β具有各种免疫学活性，例如抗病毒活性、细胞生长抑制或抗增殖活性、淋巴细胞细胞毒性增强活性、免疫调节活性、靶细胞的分化诱导或抑制活性、巨噬细胞的活化活性、细胞因子产生的活性增加、细胞毒性t细胞的活性效应增加，天然杀伤细胞的活性增加等，加上多发性硬化。相应地，据报道，干扰素β有效治疗癌症、自身免疫性病症、病毒感染、hiv相关疾病、丙型肝炎、类风湿性关节炎等等。

4、目前，存在可用于治疗的两种类型的干扰素β。首先，干扰素β-1a是一种糖基化蛋白，其由包括人干扰素β基因的中国仓鼠卵巢(cho)产生，由166个氨基酸残基组成，并且具有22kd的大小。其次，干扰素β-1b是由大肠杆菌(e.coil)产生、由165个氨基酸残基组成的蛋白质，其中糖被缺失，作为第一个氨基酸的甲硫氨酸残基被缺失，并且用丝氨酸取代第17个半胱氨酸残基。目前已商品化的干扰素β-1a包括rebif和avonex，而干扰素β-1b包括betaseron和extavia。

5、另一方面，人干扰素β也是一类糖蛋白，并且由于与蛋白质相连的糖链部分在蛋白质的活性中起重要作用，因此在糖蛋白的情况下，当添加糖链时，其活性可能是增加的。即，已知蛋白质糖基化可能影响许多生物化学性质，例如稳定性、溶解度、细胞内运输活性、药代动力学和抗原性。

6、相应地，已报道了通过将糖链引入糖蛋白、人天然干扰素β内，来制备具有增加或改善的活性或功能的人干扰素β变体的实例(韩国专利注册号0781666)。如本文使用的，人干扰素β变体r27t是重组人干扰素β变体(下文，rhinf-β)，其通过用苏氨酸(thr)取代在位置27处的精氨酸(arg)用于在干扰素β1a的位置25处的另外糖基化进行设计，并且与野生型干扰素β1a(rebif)相比，显示出稳定性增加、蛋白质聚集趋势降低和半衰期增加的效应。即，r27t是通过定点诱变的另外糖基化生成的rhinf-β的生物改良药(biobetter)。

7、同时，蛋白质药物的开发中的主要任务之一是提供这样的蛋白质，其提供足够的化学、物理和生物学稳定性，以在纯化过程和贮存过程中显示出改善的稳定性。然而，由于蛋白酶解途径中的各种固有敏感性、以及具有蛋白质的不同水平的大分子、二级、三级和四级结构的蛋白质结构的复杂性，仍然难以实现高稳定性。

8、作为第一种重组肽激素的胰岛素于1982年首次获批，并且已成功生产30余年，并且目前已相继报道了众多重组蛋白/肽药物的成功案例。然而，在生物药物的开发过程中，特别是在制剂方面，由于各种因素例如蛋白质聚集、物理化学不稳定、低半衰期、低溶解度和药代动力学性质，仍然面临着困难。

9、特别地，蛋白质聚集和降解是在几乎所有生物制药过程中容易出现的主要问题之一，其中治疗性蛋白质在贮存期间在溶液中是结构/热力学上不稳定的。因为治疗性蛋白质对由于在纯化、加工和贮存过程中的各种因素的结构变化很敏感，因此当蛋白质暴露于严酷条件下例如反复冷冻/融化和贮存于具有不同ph的缓冲液中时，这些问题可能加剧。另外，因为基于蛋白质的生物药物具有物理降解，例如由于解折叠、聚集和非天然折叠的不溶性颗粒形成的可能性，因此重要的是避免蛋白质聚集或物理变性并且使稳定性达到最大。

10、在2004年，已开发了引起干扰素的糖基化突变的干扰素β突变蛋白(韩国专利号781666)，并且已进行了将该蛋白质用作治疗剂的研究。因为干扰素β是较不稳定的，因此在纯化过程中，通常发生降解反应，例如肽键的切割、脱酰胺和甲硫氨酸氧化为硫化甲硫氨酸和二硫键交换(us2012/0177603)，但有必要考虑这些降解反应。

11、相应地，有必要开发一种人干扰素β变体，其显示出比天然干扰素β的药物效应更佳的功效，并且需要用于以高产率获得人干扰素β变体的方法。

技术实现思路

技术特征：

1.一种人干扰素β变体，其包含具有丝氨酸取代人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1的人干扰素β变体。

3.权利要求2的多核苷酸，其中所述人干扰素β变体是包含seq id no:3的氨基酸序列的人干扰素β变体。

4.一种在动物细胞中表达人干扰素β的表达载体，其包含权利要求2的多核苷酸。

5.一种动物细胞，其用权利要求4的表达载体进行转化。

6.一种用于制备人干扰素β变体的方法，其包括培养权利要求5的动物细胞。

7.一种药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1的人干扰素β变体，其中所述药物组合物具有天然人干扰素β的药物效应。

8.权利要求7的药物组合物，其中所述药物组合物具有天然人干扰素β的药物效应，并且所述药物效应是预防或治疗选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、hiv相关疾病和丙型肝炎的疾病的药物效应。

9.一种用于改善人干扰素βr27t变体的稳定性的方法，其包括用丝氨酸取代人干扰素βr27t变体中的第17个氨基酸半胱氨酸，在所述人干扰素βr27t变体中，苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

10.权利要求9的方法，其中所述人干扰素βr27t变体由seq id no:2的氨基酸序列组成。

11.权利要求9的方法，其中所述稳定性选自纯化稳定性、贮存稳定性和冷冻/融化稳定性。

12.权利要求11的方法，其中所述纯化稳定性改善了2种糖基化蛋白的纯化效率。

13.权利要求11的方法，其中所述纯化稳定性减少了在浓缩和缓冲液更换过程中的蛋白质聚集和降解。

14.权利要求11的方法，其中所述贮存稳定性是在ph 2.0至6.0的缓冲液中的贮存稳定性。

15.权利要求14的方法，其中所述缓冲液是选自以下的缓冲液：乙酸、磷酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、乳酸、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠溶液、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢盐、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-乙磺酸)(hepes)、2-(2-氨基-2-氧乙基)氨基乙磺酸(aces)、n-(2-乙酰氨基)2-亚氨基二乙酸(ada)、3-(1,1-二甲基)-1,2-羟乙基氨基-2-丙磺酸(ampso)、n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、n,n-双(2-羟乙基甘氨酸(bicine)、双-三(双(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(caps)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(capso)、2-(n-环己基氨基)乙磺酸(ches)、3-n,n-双(2-羟乙基氨基-2-羟基-丙磺酸(dipso)、n-(2-羟乙基哌嗪)-n'-(3-丙磺酸)(hepps)、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-羟基丙磺酸(heppso)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、三乙醇胺、咪唑、甘氨酸、乙醇胺、磷酸盐、3-(n-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(mopso)、哌嗪-n,n'-双(2-乙磺酸(pipes)、哌嗪-n,n'-双(2-羟基丙磺酸(popso)、n-三羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(taps)、3-n-三(羟甲基)甲基氨基-2-氢羟基丙磺酸(tapso)、n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(tes)、n-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇和2-氨基-2-甲基-1-丙醇。

16.权利要求11的方法，其中所述冷冻/融化稳定性是在-100℃至-10℃下冷冻后的融化稳定性。

17.权利要求11的方法，其中所述冷冻/融化稳定性是在乙酸缓冲液中的冷冻/融化稳定性。

18.权利要求11的方法，其中所述冷冻/融化稳定性减少在3次或更多次冷冻/融化循环后的蛋白质聚集和降解。

19.权利要求1的人干扰素β变体用于制备药剂的用途，所述药剂具有天然人干扰素β对选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、hiv相关疾病和丙型肝炎的疾病的药物效应。

20.一种用于治疗选自多发性硬化、癌症、自身免疫性病症、病毒感染、hiv相关疾病和丙型肝炎的疾病的方法，其包括将有效量的组合物施用于有此需要的受试者，所述组合物具有天然人干扰素β的药物效应并且包含权利要求1的人干扰素β变体。

21.一种人干扰素β变体，其具有丝氨酸取代seq id no:1的人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代第27个氨基酸精氨酸，与seq id no:1的野生型干扰素β具有至少90％的序列同源性，并且具有干扰素β的活性。

技术总结
本发明涉及具有双重突变的人干扰素β变体和用于改善人干扰素β变体的稳定性的方法，并且更具体而言，涉及包含具有丝氨酸取代人干扰素β的第17个氨基酸半胱氨酸和苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸的氨基酸序列的人干扰素β变体、以及用于改善人干扰素βR27T变体的稳定性的方法，该方法包括用丝氨酸取代人干扰素βR27T变体中的第17个氨基酸半胱氨酸的步骤，在所述人干扰素βR27T变体中，用苏氨酸取代人干扰素β的第27个氨基酸精氨酸。

技术研发人员：崔俊英,金娜荣,孙元洛,洪性贤,李镕辰,李世炯
受保护的技术使用者：瑷备恩有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11