SARM1的双等位基因敲除的制作方法

背景技术：

1、含有不育α和tir基序的1(sarm1)基因是nad+水解酶，其通过促进沃勒变性(一种损伤诱导形式的程序性亚细胞死亡，涉及损伤位点远端轴突的变性)作为myd88和trif依赖性toll样受体信号传导途径的负调节因子。sarm1还可以响应于应激而激活神经元细胞死亡并且在视网膜结构和功能中发挥作用(莫尔德伊(molday)等人，2013)。

技术实现思路

1、公开了敲除sarm1基因以抑制光感受器变性，从而使眼睛中的光感受器保持不变的方法。因此，如本文所述的感光细胞中sarm1基因的双等位基因敲除可用于治疗、抑制、预防和/或改善色素性视网膜炎、光感受器(视杆和视锥)变性和年龄相关性黄斑变性中的任一种。

2、本公开还提供了一种用于使细胞中含有不育α和tir基序的1(sarm1)基因的等位基因失活的方法，该方法包括

3、向细胞中引入组合物，该组合物包括：

4、crispr核酸酶或编码该crispr核酸酶的序列；以及

5、包括具有17至50个核苷酸的引导序列部分或编码其的核苷酸序列的rna分子，

6、其中crispr核酸酶和rna分子的复合物影响sarm1基因的等位基因中的双链断裂。

7、根据本发明的实施例，提供了一种rna分子，其包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

8、根据本发明的一些实施例，提供了一种包括rna分子和crispr核酸酶的组合物，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

9、根据本发明的一些实施例，提供了一种用于使细胞中的sarm1等位基因失活的方法，该方法包括向细胞递送包括rna分子和crispr核酸酶的组合物，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。在一些实施例中，细胞是视杆细胞。在一些实施例中，细胞是视锥细胞。在一些实施例中，细胞是感光细胞。在一些实施例中，向细胞的递送在体内、离体或体外进行。在一些实施例中，该方法离体进行，并且从个体患者提供/取出细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括将具有修饰/敲除的sarm1等位基因的所得细胞引入至个体患者的步骤。

10、根据本发明的一些实施例，提供了一种用于治疗和/或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的方法，该方法包括向患有色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的细胞递送包括rna分子和crispr核酸酶的组合物，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

11、根据本发明的一些实施例，提供了包括rna分子和crispr核酸酶的组合物的用于使细胞中的sarm1等位基因失活的用途，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸，该用途包括向细胞递送包括rna分子和crispr核酸酶的组合物，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

12、根据本发明的实施例，提供了一种用于使细胞中的sarm1等位基因失活的包括rna分子和crispr核酸酶的药物，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸，其中该药物通过向细胞递送包括rna分子和crispr核酸酶的组合物来加以施用，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

13、根据本发明的一些实施例，提供了包括rna分子和crispr核酸酶的组合物的用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的用途，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸，该用途包括向患有色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的细胞递送包括rna分子和crispr核酸酶的组合物，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

14、在一些实施例中，该方法在体内进行，并且该细胞是受试者眼睛视网膜中的感光细胞。

15、根据本发明的一些实施例，提供了一种包括组合物的药物，该组合物包括rna分子和crispr核酸酶，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个中所示序列中的核苷酸，其用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性，其中该药物通过向患有色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的细胞递送包括rna分子和crispr核酸酶的组合物来加以施用，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

16、根据本发明的一些实施例，提供了一种用于使细胞中的sarm1等位基因失活的试剂盒，其包括rna分子、crispr核酸酶和/或tracrrna分子，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸；以及用于将rna分子；crispr核酸酶和/或tracrrna递送至细胞的说明书。

17、根据本发明的一些实施例，提供了一种用于治疗受试者中的光感受器变性的试剂盒，其包括rna分子、crispr核酸酶和/或tracrrna分子，该rna分子包括具有17至50个连续核苷酸的引导序列部分，这些连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸；和用于将rna分子；crispr核酸酶和/或tracrrna递送至患有光感受器变性或具有经历光感受器变性的风险的受试者的细胞的说明书。

1.一种用于使细胞中含有不育α和toll/白介素-1受体基序的1(sarm1)基因的等位基因失活的方法，所述方法包括

2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述组合物引入至受试者体内的细胞或培养物中的细胞。

3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞是感光细胞，优选地视杆细胞或视锥细胞。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中将所述crispr核酸酶和所述rna分子在基本上相同的时间或在不同的时间引入至所述细胞。

5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞中所述sarm1基因的等位基因经历插入或缺失突变。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述插入或缺失突变产生早期终止密码子。

7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中所述失活导致由所述失活的等位基因编码的截短蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中引导序列部分与位于所述sarm1基因的外显子i、外显子ii、外显子iii、外显子iv、外显子v、外显子vi、外显子vii、外显子viii或外显子ix上游50个碱基对处至下游50个碱基对处的靶序列互补。

9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中所述引导序列部分与位于所述sarm1基因的外显子上游7个碱基对处至下游7个碱基对处的靶序列互补，且

10.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述引导序列部分包括17至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

11.一种包括rna分子的组合物，所述rna分子包括引导序列部分，所述引导序列部分包括17至50个连续核苷酸，其中所述引导序列部分与位于所述sarm1基因的外显子i、外显子ii、外显子iii、外显子iv、外显子v、外显子vi、外显子vii、外显子viii或外显子ix上游50个碱基对处至下游50个碱基对处的靶序列互补。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述引导序列部分与位于所述sarm1基因的外显子上游7个碱基对处至下游7个碱基对处的靶序列互补，且

13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述引导序列部分包括17至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有seq id no:1-12105中任一个所示序列中的核苷酸。

14.根据权利要求11至13中任一权利要求所述的组合物，其进一步包括crispr核酸酶。

15.根据权利要求11至14中任一权利要求所述的组合物，其进一步包括反式激活crispr rna(tracrrna)分子。

16.根据权利要求11至15中任一权利要求所述的组合物，其中所述crispr核酸酶和rna分子或crispr核酸酶、rna分子和tracrrna分子形成复合物。

17.一种包括根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物的药物，其用于使细胞中的sarm1等位基因失活，其中所述药物通过向所述细胞递送根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物来加以施用。

18.一种根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的用途，其包括将根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者。

19.一种包括根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物的药物，其用于治疗、改善或预防色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性，其中所述药物通过将根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者来加以施用。

20.一种用于使细胞中的sarm1等位基因失活的试剂盒，其包括根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物和将所述组合物递送至所述细胞的说明书。

21.一种用于治疗或预防受试者的色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的试剂盒，其包括根据权利要求11至16中任一权利要求所述的组合物和用于将所述组合物递送至经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性或具有经历色素性视网膜炎、光感受器变性或年龄相关性黄斑变性的风险的受试者的说明书。