低丰度核酸的检测的制作方法

背景技术：

1、核酸检测是医学、工业和研究领域中的重要过程。例如，痕量核酸检测(tracenucleic acid detection)提供了关于病毒传播的信息，或者为可能遭受核酸污染的生物技术提供了重要的控制。生物药物(例如，在宿主细胞中由重组表达合成的药物)需要高纯度，其不含外来核酸。需要检测这些痕量核酸的改进的方法。

技术实现思路

1、本文提供了检测痕量核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：提供来自来源的样品，其中所述来源包含不超过1纳克的核酸；使所述样品与至少一种扩增引物、至少一种链置换聚合酶和核苷酸混合物接触以产生复制产物；以及测量从复制产物获得的信号，其中大于1.01的信噪比(snr)指示所述样品包含痕量核酸。本文还提供了方法，其中所述样品包含不超过0.1纳克的核酸。本文还提供了方法，其中所述样品包含不超过1皮克的核酸。本文还提供了方法，其中所述样品包含不超过1毫微微克的核酸。本文还提供了方法，其中所述核酸包含不超过5000万个核苷。本文还提供了方法，其中所述核酸包含不超过100,000个核苷。本文还提供了方法，其中所述核酸包含不超过10,000个核苷。本文还提供了方法，其中所述核酸具有200-2000个碱基的平均长度。本文还提供了方法，其中所述核酸具有至少1000个碱基的平均长度。本文还提供了方法，其中所述方法还包括根据无模板对照实验建立噪声量。本文还提供了方法，其中接触发生不超过10小时。本文还提供了方法，其中接触发生不超过4小时。本文还提供了方法，其中接触发生不超过2小时。本文还提供了方法，其中信噪比大于1000。本文还提供了方法，其中snr大于1.05指示所述样品包含痕量核酸。本文还提供了方法，其中snr大于1.1指示所述样品包含痕量核酸。本文还提供了方法，其中所述信号是荧光、磷光、化学发光或比色。本文还提供了方法，其中所述核酸包括来源于细菌、酵母、真菌、霉菌、昆虫或人类来源的核酸。本文还提供了方法，其中所述样品从含酶试剂、药物组合物、靴子或尸体拭子、血液、毛发、皮肤、唾液和人类临床分离物中的一种或多种获得。本文还提供了方法，其中所述样品还包含蛋白质。本文还提供了方法，其中所述蛋白质是重组表达的蛋白质。本文还提供了方法，其中所述样品包含至少一种核酸，并且所述至少一种核酸在步骤b)中被扩增。本文还提供了方法，其中扩增在基本上等温的条件下进行。本文还提供了方法，其中扩增在其中温度变化不超过10℃的条件下进行。本文还提供了方法，其中扩增在其中温度变化不超过5℃的条件下进行。本文还提供了方法，其中所述核酸聚合酶是dna聚合酶。本文还提供了方法，其中所述dna聚合酶是链置换dna聚合酶。本文还提供了方法，其中所述核酸聚合酶是噬菌体phi29(φ29)聚合酶、基因修饰的phi29(φ29)dna聚合酶、dna聚合酶i的klenow片段、噬菌体m2 dna聚合酶、噬菌体phiprd1 dna聚合酶、bstdna聚合酶、bst大片段dna聚合酶、exo(-)bst聚合酶、exo(-)bca dna聚合酶、bsu dna聚合酶、ventr dna聚合酶、ventr(exo-)dna聚合酶、deep vent dna聚合酶、deep vent(exo-)dna聚合酶、isopol dna聚合酶、dna聚合酶i、therminator dna聚合酶、t5 dna聚合酶、测序酶、t7 dna聚合酶、t7-测序酶或t4 dna聚合酶。本文还提供了方法，其中所述核酸聚合酶不包含3'->5'核酸外切酶活性。本文还提供了方法，其中所述聚合酶是bst dna聚合酶、exo(-)bst聚合酶、exo(-)bca dna聚合酶、bsu dna聚合酶、ventr(exo-)dna聚合酶、deep vent(exo-)dna聚合酶、klenow片段(exo-)dna聚合酶或therminator dna聚合酶。本文还提供了方法，其中所述核苷酸混合物包含至少一种通过链置换聚合酶终止核酸复制的终止子核苷酸。本文还提供了方法，其中所述核酸聚合酶包含3'->5'核酸外切酶活性，并且所述至少一种终止子核苷酸抑制所述3'->5'核酸外切酶活性。本文还提供了方法，其中所述至少一种终止子核苷酸包含脱氧核糖的3'碳的r基团的修饰。本文还提供了方法，其中所述至少一种终止子核苷酸选自含有核苷酸的3'封闭的可逆终止子、含有核苷酸的3'未封闭的可逆终止子、含有脱氧核苷酸的2'修饰的终止子、含有对脱氧核苷酸的含氮碱基的修饰的终止子，及其组合。本文还提供了方法，其中所述至少一种终止子核苷酸选自双脱氧核苷酸、反向双脱氧核苷酸、3'生物素化核苷酸、3'氨基核苷酸、3'-磷酸化核苷酸、3'-o-甲基核苷酸、包括3'c3间隔子核苷酸的3'碳间隔子核苷酸、3'c18核苷酸、3'己二醇间隔子核苷酸、无环核苷酸，及其组合。本文还提供了方法，其中所述至少一种终止子核苷酸选自具有对α基团的修饰的核苷酸、c3间隔子核苷酸、锁核酸(lna)、反向核酸、2'氟代核苷酸、3'磷酸化核苷酸、2'-o-甲基修饰的核苷酸和反式核酸。本文还提供了方法，其中具有对α基团的修饰的核苷酸是α-硫代双脱氧核苷酸。本文还提供了方法，其中所述扩增引物的长度为4至70个核苷酸。本文还提供了方法，其中所述至少一种扩增引物的长度为4至20个核苷酸。本文还提供了方法，其中所述至少一种扩增引物包含随机化区域。本文还提供了方法，其中所述随机化区域的长度为4至20个核苷酸。本文还提供了方法，其中所述随机化区域的长度为8至15个核苷酸。本文还提供了方法，其中扩增产物的长度为约50至约2000个核苷酸。本文还提供了方法，其中扩增产物的长度为约200至约1000个核苷酸。本文还提供了方法，其中所述扩增进行5-15个循环。本文还提供了方法，其中所述扩增进行不超过20个循环。本文还提供了方法，其中所述方法还包括qpcr。本文还提供了方法，其中至少一种扩增引物包含可裂解的荧光团和猝灭剂。本文还提供了方法，其中所述方法包括至少四种扩增引物。本文还提供了方法，其中所述方法还包括使所述样品与单链dna结合蛋白接触。本文还提供了方法，其中所述方法还包括使所述样品与解旋酶接触。本文还提供了方法，其中所述方法还包括使所述样品与切口酶接触。本文还提供了方法，其中所述方法还包括使所述样品与逆转录酶接触。本文还提供了方法，其中所述方法还包括定量所述样品中核酸的浓度。本文还提供了方法，其中所述方法还包括丢弃或再纯化被发现含有痕量核酸的样品。

2、援引并入

3、本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地指示通过引用并入。

技术特征：

1.一种检测痕量核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含不超过0.1纳克的核酸。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含不超过1皮克的核酸。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含不超过10毫微微克的核酸。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸包含不超过5000万个核苷。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述核酸包含不超过100,000个核苷。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述核酸包含不超过10,000个核苷。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述核酸具有200-2000个碱基的平均长度。

9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述核酸具有至少1000个碱基的平均长度。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括根据无模板对照实验建立噪声量。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中接触发生不超过10小时。

12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中接触发生不超过4小时。

13.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中接触发生不超过2小时。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述信噪比大于1000。

15.如权利要求14所述的方法，其中snr大于1.05指示所述样品包含痕量核酸。

16.如权利要求14所述的方法，其中snr大于1.1指示所述样品包含痕量核酸。

17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述信号是荧光、磷光、化学发光或比色。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述核酸包括来源于细菌、酵母、真菌、霉菌、昆虫或人类来源的核酸。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述样品从含酶试剂、药物组合物、靴子或尸体拭子、血液、毛发、皮肤、唾液和人类临床分离物中的一种或多种获得。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述样品还包含蛋白质。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质是重组表达的蛋白质。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述样品包含至少一种核酸，并且所述至少一种核酸在步骤b)中被扩增。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述扩增在基本上等温的条件下进行。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述扩增在其中温度变化不超过10℃的条件下进行。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述扩增在其中温度变化不超过5℃的条件下进行。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶是dna聚合酶。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述dna聚合酶是链置换dna聚合酶。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述核酸聚合酶是噬菌体phi29(φ29)聚合酶、基因修饰的phi29(φ29)dna聚合酶、dna聚合酶i的klenow片段、噬菌体m2 dna聚合酶、噬菌体phiprd1dna聚合酶、bst dna聚合酶、bst大片段dna聚合酶、exo(-)bst聚合酶、exo(-)bcadna聚合酶、bsu dna聚合酶、ventr dna聚合酶、ventr(exo-)dna聚合酶、deep vent dna聚合酶、deep vent(exo-)dna聚合酶、isopoldna聚合酶、dna聚合酶i、therminator dna聚合酶、t5 dna聚合酶、测序酶、t7 dna聚合酶、t7-测序酶或t4 dna聚合酶。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶不包含3'->5'核酸外切酶活性。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述聚合酶是bst dna聚合酶、exo(-)bst聚合酶、exo(-)bca dna聚合酶、bsu dna聚合酶、ventr(exo-)dna聚合酶、deep vent(exo-)dna聚合酶、klenow片段(exo-)dna聚合酶或therminator dna聚合酶。

31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述核苷酸混合物包含至少一种通过所述链置换聚合酶终止核酸复制的终止子核苷酸。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述核酸聚合酶包含3'->5'核酸外切酶活性，并且所述至少一种终止子核苷酸抑制所述3'->5'核酸外切酶活性。

33.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一种终止子核苷酸包含脱氧核糖的3'碳的r基团的修饰。

34.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一种终止子核苷酸选自含有核苷酸的3'封闭的可逆终止子、含有核苷酸的3'未封闭的可逆终止子、含有脱氧核苷酸的2'修饰的终止子、含有对脱氧核苷酸的含氮碱基的修饰的终止子，及其组合。

35.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一种终止子核苷酸选自双脱氧核苷酸、反向双脱氧核苷酸、3'生物素化核苷酸、3'氨基核苷酸、3'-磷酸化核苷酸、3'-o-甲基核苷酸、包括3'c3间隔子核苷酸的3'碳间隔子核苷酸、3'c18核苷酸、3'己二醇间隔子核苷酸、无环核苷酸，及其组合。

36.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一种终止子核苷酸选自具有对α基团的修饰的核苷酸、c3间隔子核苷酸、锁核酸(lna)、反向核酸、2'氟代核苷酸、3'磷酸化核苷酸、2'-o-甲基修饰的核苷酸和反式核酸。

37.如权利要求31所述的方法，其中所述具有对α基团的修饰的核苷酸是α-硫代双脱氧核苷酸。

38.如权利要求31所述的方法，其中所述扩增引物的长度为4至70个核苷酸。

39.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一种扩增引物的长度为4至20个核苷酸。

40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述至少一种扩增引物包含随机化区域。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述随机化区域的长度为4至20个核苷酸。

42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述随机化区域的长度为8至15个核苷酸。

43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中扩增产物的长度为约50至约2000个核苷酸。

44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述扩增产物的长度为约200至约1000个核苷酸。

45.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述扩增进行5-15个循环。

46.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述扩增进行不超过20个循环。

47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述方法还包括qpcr。

48.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中至少一种扩增引物包含可裂解的荧光团和猝灭剂。

49.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少四种扩增引物。

50.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述样品与单链dna结合蛋白接触。

51.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述样品与解旋酶接触。

52.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述样品与切口酶接触。

53.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述样品与逆转录酶接触。

54.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述方法还包括定量所述样品中核酸的浓度。

55.如权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述方法还包括丢弃或再纯化被发现含有痕量核酸的样品。

技术总结
本文提供了用于检测核酸的组合物和方法。还提供了使用原代模板定向扩增(PTA)来检测痕量核酸的方法。此类方法在一些情况下应用于诊断学、生物技术和药物制造以及食品安全。

技术研发人员：查尔斯·加瓦德,悉达多·卡迪亚,杰伊·A·A·韦斯特
受保护的技术使用者：铂赛基因组学公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13