低聚糖从细菌细胞中改善的输出的制作方法

背景技术：

1、低聚糖是由少量通过糖苷键彼此连接的单糖部分组成的糖分子。低聚糖具有能量储存、细胞识别和细胞粘附等多种功能，在医学和营养学领域具有重要意义。此外，低聚糖可以作为益生元。

2、低聚糖可以作为连接到蛋白质或脂质的聚糖存在。天然存在的非糖蛋白或糖脂组分的低聚糖的实例为由微生物分解淀粉产生的麦芽糖糊精。另一个实例为微生物响应渗透压而产生的渗透调节低聚糖。

3、一些低聚糖是不可消化的低聚糖，即不能在人小肠中消化的低聚糖。这些不可消化的低聚糖最近引起了人们的极大兴趣，因为它们可能具有益生元的作用。因此，它们通过大肠，在那里它们促进双歧杆菌(bifidobacteria)的生长，双歧杆菌被认为对消化系统有益。这些膳食低聚糖的一个子集，即所谓的人乳低聚糖(hmo)特别令人感兴趣，因为它们仅存在于母乳中，并且经鉴定有助于婴儿健康微生物群、免疫系统及其认知能力的发育。

4、由于在除了母乳以外的天然来源中仅发现了一些hmo，例如在小须鲸、非洲狮、北极熊、倭黑猩猩、黑猩猩和猩猩的乳汁中发现了最主要的人乳低聚糖2’-岩藻糖基乳糖，但在驯养的产奶动物的乳汁中未发现，因此需要生产这些hmo–而非从自然资源中分离–以使它们可用作营养组合物的成分，所述营养组合物包括但不限于婴儿配方物。理论上，低聚糖可以通过化学合成或体外生物催化生产。低聚糖的化学合成包括在糖链的还原或非还原末端逐步加入单糖部分，所述加入包括引入和除去保护基。进一步考虑到立体化学的特性，结果证明化学合成不适合于以合理的成本向食品工业提供工业规模的低聚糖。或者，低聚糖可通过生物化学反应产生，其中酶在体外催化糖部分之间糖苷键的形成。然而，生物催化也不适合于以合理的成本以工业规模生产低聚糖，使得低聚糖可用于营养组合物中。

5、为了克服化学法和生物化学法生产低聚糖的缺点，近年来利用重组大肠杆菌(e.coli)细胞发酵生产一些低聚糖。在这些过程中，将能够在细胞内合成目标低聚糖的基因工程化大肠杆菌细胞在培养基中并且在允许大肠杆菌细胞合成目标低聚糖的条件下进行培养。在发酵步骤结束时，从培养基和/或大肠杆菌细胞中回收目标低聚糖。

6、从培养基中而非从细菌细胞中回收目标低聚糖是有利的，因为前者的回收相比从细胞裂解物中回收包括更少的工艺步骤，成本更低且不太繁琐。此外，使目标低聚糖从细菌细胞输出到培养基中是有益的，因为目标低聚糖的细胞内积累对细菌细胞产生渗透压，并因此影响生产力。因此，期望诱导或增强由微生物生产菌株在细胞内合成的目标低聚糖从细胞质向培养所述细菌细胞的培养基的输出。

7、国际出版物wo 2015/197082 a1公开了使用基因工程化大肠杆菌(escherichiacoli)菌株生产人乳低聚糖，所述菌株表达编码用于蔗糖内化的内膜转运蛋白和外膜孔蛋白的异源scra和scry基因等。

8、国际出版物wo 2018/165072 a1教导了通过表达异源多糖转运蛋白的komatageibacter菌株生产胞外多糖。

9、whitney,j.c.和howell,p.l.(synthase-dependent exopolysaccharidesecretion in gram-negative bacteria；trends in microbiology(2003),vol.21,no.2,第63-72页)综述了细菌细胞表面多糖分泌的机制，并讨论了该途径的关键保守组分(conserved component)。这些组分包括内膜包埋的多糖合成酶、含有周质的三四氨基酸重复基序(tpr)的支架蛋白和外膜β-桶状孔蛋白。

10、国际出版物wo 2017/042382 a1公开了使用基因工程化大肠杆菌菌株生产人乳低聚糖，所述菌株表达不同的异源低聚糖输出蛋白，包括yjhb、seta和prop。

11、国际出版号wo 2010/142305 a1公开了岩藻糖基乳糖的生产，其中使用表达糖外排转运蛋白(set)家族成员的基因工程化大肠杆菌。

12、国际出版物wo 2018/077892 a1公开了使用基因工程化大肠杆菌菌株生产岩藻糖基化低聚糖，所述菌株表达yberc0001_9420伯氏耶尔森菌(yersinia bercovieri)糖外排转运蛋白以输出2’-岩藻糖基乳糖。

13、出人意料地发现，糖转运蛋白和/或孔蛋白在能够合成目标低聚糖的革兰氏阴性细菌细胞中的重组表达介导或至少促进所需低聚糖从细胞质转运到培养基中。

技术实现思路

1、在第一方面，提供了用于生产目标低聚糖的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞能够在细胞内合成目标低聚糖，并且在其内膜中具有糖转运蛋白和/或在其外膜中具有孔蛋白，用于将目标低聚糖从细胞质转运到培养基中，其中糖转运蛋白和/或孔蛋白由重组基因或去调节的内源基因表达。

2、在第二方面，提供了基因工程化革兰氏阴性细菌细胞用于生产目标低聚糖的用途，所述细胞能够在细胞内合成目标低聚糖，并且在其内膜中具有糖转运蛋白和/或在其外膜中具有孔蛋白，用于将目标低聚糖从细胞质转运到培养基中，其中糖转运蛋白和/或孔蛋白由重组基因或去调节的内源基因表达。

3、在第三方面，提供了用于生产目标低聚糖的方法，其中目标低聚糖在根据第一方面的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞中合成，从细菌细胞的细胞质跨过细菌细胞的内膜和外膜转运到培养基中，并且从培养基中回收。

4、在另一方面，提供了一种用于增强在基因工程化革兰氏阴性细菌细胞中生产的目标低聚糖跨过所述革兰氏阴性细菌细胞的内膜和外膜转运到培养基中的方法。

技术特征：

1.用于生产目标低聚糖的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞

2.根据权利要求1所述的基因工程化细菌细胞，其中所述目标低聚糖为人乳低聚糖。

3.根据权利要求2所述的基因工程化细菌细胞，其中所述人乳低聚糖选自中性hmo和唾液酸化hmo，优选地选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-n-丙糖ii、乳-n-四糖、乳-n-新四糖、乳-n-岩藻五糖i、乳-n-新岩藻五糖i、乳-n-岩藻五糖ii、乳-n-岩藻五糖iii、乳-n-岩藻五糖v、乳-n-新岩藻五糖v、乳-n-二岩藻六糖i、乳-n-二岩藻六糖ii、3’-半乳糖基乳糖、6’-半乳糖基乳糖、乳-n-六糖、乳-n-新六糖、对-乳-n-六糖、对-乳-n-新六糖、二岩藻糖基-乳-n-新六糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳-n-唾液酸五糖a、乳-n-唾液酸五糖b、乳-n-唾液酸五糖c、岩藻糖基-乳-n-唾液酸五糖a、岩藻糖基-乳-n-唾液酸五糖b、岩藻糖基-乳-n-唾液酸五糖c、二唾液酸-乳-n-四糖、二唾液酸-乳-n-岩藻五糖、二唾液酸-乳-n-岩藻五糖、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖、3-岩藻糖基-6’-唾液酸乳糖和乳-n-新二岩藻六糖i。

4.根据前述权利要求中任一项所述的基因工程化细菌细胞，其中所述糖转运蛋白为内源转运蛋白或非内源转运蛋白，和/或其中所述孔蛋白为内源孔蛋白或非内源孔蛋白。

5.根据权利要求4所述的基因工程化细菌细胞，其中所述细菌细胞已被基因工程化以过表达所述内源糖转运蛋白和/或所述内源孔蛋白。

6.根据权利要求4所述的基因工程化细菌细胞，其中所述细菌细胞已被基因工程化以过表达所述非内源糖转运蛋白和/或所述非内源孔蛋白。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的革兰氏阴性细菌细胞用于生产目标低聚糖的用途。

8.一种生产目标低聚糖的方法，所述方法包括以下步骤

9.一种用于增强目标低聚糖从革兰氏阴性细菌细胞向培养所述细菌细胞的培养基中输出的方法，其中所述细菌细胞已被基因工程化以在细胞内合成目标低聚糖，所述方法包括在所述细菌细胞中表达来自重组基因的非内源糖转运蛋白和/或非内源孔蛋白，和/或通过去调节内源糖转运蛋白和/或内源孔蛋白基因的表达的步骤。

技术总结
本发明公开了用于生产目标低聚糖的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞具有由重组基因或去调节的内源基因表达的糖转运蛋白和/或孔蛋白，从而促进目标低聚糖从细胞质转运到细胞环境中。还公开了使用所述基因工程化革兰氏阴性细菌细胞生产目标低聚糖的方法。

技术研发人员：M·恩格勒特,S·詹尼温,H·弗雷格曼,K·帕沙特,C·特罗切尔
受保护的技术使用者：科汉森母乳低聚糖股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12