用于亲和结合和细胞培养的活化的可溶性载体的制作方法

本公开一般涉及活化的可溶性载体。具体地，本公开涉及用于细胞培养和细胞捕获的活化的可溶性载体。

背景技术：

1、细胞疗法作为许多疾病的治疗方法正越来越受欢迎。在常规的细胞疗法中，生产方法是劳动密集型的并且为小批量生产的形式。然而，许多新兴的细胞疗法需要从异质的细胞混合物中分离出感兴趣的低频细胞，随后大规模扩增捕获的细胞。常规的小批量生产技术不能应对并满足细胞疗法生产方法的日益增长的需求，以允许分离目标细胞并有效地培养细胞。

2、在常规的细胞分离技术中，采用配体-受体相互作用来分离细胞，并且配体需固定在固体载体上。然而，将配体固定在固体载体上的常规方法依赖于羧酸基团的活化，该活化影响载体的机械完整性并且可能导致载体在进一步的加工期间降解。

技术实现思路

1、本公开的实施方式提供了活化的可溶性载体。所述载体允许进行细胞培养和/或细胞捕获，同时在细胞培养基中维持机械完整性。可溶性载体不需要聚合物粘附涂层，因为允许进行细胞捕获或细胞培养的配体是共价固定的，并因此可以耐久地附接于可溶性载体。由于可溶性载体中的离子交联的性质，载体在细胞培养基的存在下保持机械完整性。

2、由于载体是可溶的并因此在需要时可消失，因此根据本公开实施方式所述的载体能够简化下游的处理。因此，可溶性载体增强了捕获的细胞或培养的细胞的回收，因为载体自身可在需要时溶解，例如通过加入酶进行消化来溶解。另外，可溶性载体可以为任何合适的形式(例如，珠、纤维、泡沫整料等)，并且不限于在平面表面上进行细胞培养，例如，不限于二维(2d)单层细胞培养。

3、在一方面中，一种活化的可溶性载体包括离子移变交联的化合物，其包括具有至少一个重复单元的聚合物材料，所述至少一个重复单元包括：离子移变交联的羧酸基团和活化的羟基基团，其中，羟基基团通过在溶剂中的n,n’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)或n-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯活化以形成琥珀酰亚胺基碳酸酯基团用于配体结合

4、在一些实施方式中，羧酸基团与多价阳离子离子移变交联。在一些实施方式中，溶剂是非质子溶剂。在一些实施方式中，非质子溶剂是无水溶剂。

5、在一些实施方式中，所述至少一个重复单元包括：

6、

7、在一些实施方式中，聚合物材料包括聚半乳糖醛酸(pga)化合物。在一些实施方式中，pga化合物包括下述中的至少一种：果胶酸、部分酯化的果胶酸、部分酰胺化的果胶酸或其盐。在一些实施方式中，部分酯化的果胶酸包括1摩尔％至40摩尔％的酯化度。在一些实施方式中，部分酯化的果胶酸包括1摩尔％至40摩尔％的酰胺化度。

8、在一些实施方式中，可溶性载体包括的结构包含：珠、纤维、织物、泡沫或涂层。在一些实施方式中，可溶性载体包括多孔珠。在一些实施方式中，可溶性载体包括大孔泡沫。在一些实施方式中，可溶性载体包括用于细胞培养容器的细胞培养表面的涂层。

9、在一些实施方式中，可溶性载体通过来自酶、螯合剂或其组合的消化而溶解。在一些实施方式中，酶包括非蛋白水解酶。在一些实施方式中，非蛋白水解酶选自果胶裂解酶和果胶酶。在一些实施方式中，可溶性载体的消化在小于约1小时内完成。在一些实施方式中，可溶性载体的消化在小于约15分钟内完成。在一些实施方式中，配体包含蛋白质、肽、类肽、糖或药物。

10、在一方面中，一种形成活化的可溶性载体的方法包括：形成离子移变交联的化合物，包括：通过向包含至少一种多价阳离子的溶液加入包含聚半乳糖醛酸(pga)化合物的聚合物溶液，形成可溶性载体，所述pga化合物选自下述中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐；以及通过加入活化溶液，活化可溶性载体的pga化合物中的羟基基团以形成琥珀酰亚胺基碳酸酯基团。

11、在一些实施方式中，所述方法还包括：在活化之前清洗可溶性载体以去除未结合的含羟基的化合物。在一些实施方式中，所述方法还包括：将配体偶联到活化的羟基基团以建立配体-可溶性载体偶联物。在一些实施方式中，配体包含蛋白质、肽、类肽、糖或药物。在一些实施方式中，配体-可溶性载体偶联物包括含有下述的至少一个单元：

12、

13、在一些实施方式中，所述方法还包括：在活化之后用包含至少一种多价阳离子的溶液清洗活化的可溶性载体。

14、在一些实施方式中，离子移变交联的化合物可形成为某种结构，该结构包括珠、纤维、织物或泡沫。在一些实施方式中，离子移变交联的化合物可作为涂层施涂于细胞培养表面。

15、在一些实施方式中，活化溶液包括活化剂和溶剂。在一些实施方式中，活化剂包括n,n’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)或n-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯。在一些实施方式中，溶剂包含非质子溶剂。

16、在一些实施方式中，聚半乳糖醛酸化合物包括下述中的至少一种：果胶酸、具有1摩尔％至40摩尔％酯化度或酰胺化度的部分酯化或酰胺化的果胶酸、或其盐。在一些实施方式中，聚半乳糖醛酸化合物包含小于20摩尔％的甲氧基基团。

17、在一方面中，一种用于在可溶性载体上培养细胞的方法包括：在可溶性载体上接种细胞；以及使可溶性载体与细胞培养基接触。

18、在一些实施方式中，在可溶性载体上接种细胞包括：使细胞粘附于可溶性载体的表面。在一些实施方式中，细胞在可溶性载体的孔中聚集以形成球体。

19、在一些实施方式中，使可溶性载体与细胞培养基接触包括：将可溶性载体浸没在细胞培养基中。在一些实施方式中，使可溶性载体与细胞培养基接触包括：使细胞培养基连续通过可溶性载体。在一些实施方式中，使细胞培养基连续通过可溶性载体包括：使至少一些细胞培养基不与可溶性载体接触，以及使可溶性载体与新鲜细胞培养基接触，以使得与可溶性载体接触的细胞培养基的体积保持基本上恒定。

20、在一方面中，从可溶性载体收获细胞的方法包括：通过将可溶性泡沫支架暴露于酶、螯合剂或其组合，消化可溶性载体；以及当可溶性载体被消化时，收获暴露的细胞。

21、在一些实施方式中，可溶性载体包括离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸、部分酯化的果胶酸、部分酰胺化的果胶酸及其盐，并且其中，酶包括非蛋白水解酶。在一些实施方式中，非蛋白水解酶选自果胶裂解酶和果胶酶。在一些实施方式中，消化可溶性载体包括：将可溶性载体暴露于约1u至约200u的酶。在一些实施方式中，消化可溶性载体包括：将可溶性载体暴露于约1mm至约200mm的螯合剂。

技术特征：

1.一种活化的可溶性载体，其包括：

2.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，羧酸基团与多价阳离子离子移变交联。

3.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，所述至少一个重复单元包括：

4.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，溶剂是非质子溶剂。

5.如权利要求4所述的可溶性载体，其中，非质子溶剂是无水溶剂。

6.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，聚合物材料包括聚半乳糖醛酸(pga)化合物。

7.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，pga化合物包括下述中的至少一种：果胶酸、部分酯化的果胶酸、部分酰胺化的果胶酸或其盐。

8.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，部分酯化的果胶酸包括1摩尔％至40摩尔％的酯化度。

9.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，部分酰胺化的果胶酸包括1摩尔％至40摩尔％的酰胺化度。

10.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，可溶性载体包括结构，所述结构包含：珠、纤维、织物、泡沫或涂层。

11.如权利要求10所述的可溶性载体，其中，可溶性载体包括多孔珠。

12.如权利要求10所述的可溶性载体，其中，可溶性载体包括大孔泡沫。

13.如权利要求10所述的可溶性载体，其中，可溶性载体包括涂层，所述涂层用于细胞培养容器的细胞培养表面。

14.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，可溶性载体通过来自酶、螯合剂或其组合的消化而溶解。

15.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，所述酶包括非蛋白水解酶。

16.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，非蛋白水解酶选自果胶裂解酶和果胶酶。

17.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，可溶性载体的消化在小于约1小时内完成。

18.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，可溶性载体的消化在小于约15分钟内完成。

19.如权利要求1所述的可溶性载体，其中，配体包括蛋白质、肽、类肽、糖或药物。

20.一种形成活化的可溶性载体的方法，所述方法包括：

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述方法还包括：在活化之前清洗可溶性载体以去除未结合的含羟基化合物。

22.如权利要求20所述的方法，其中，所述方法还包括：将配体偶联到活化的羟基基团以建立配体-可溶性载体偶联物。

23.如权利要求20所述的方法，其中，配体-可溶性载体偶联物包括至少一个单元，所述至少一个单元包括：

24.如权利要求20所述的方法，其中，配体包括蛋白质、肽、类肽、糖或药物。

25.如权利要求20所述的方法，其中，所述方法还包括：在活化之后用包含至少一种多价阳离子的溶液清洗活化的可溶性载体。

26.如权利要求20所述的方法，其中，离子移变交联的化合物可形成为某种结构，该结构包括珠、纤维、织物或泡沫。

27.如权利要求20所述的方法，其中，离子移变交联的化合物可作为涂层施涂于细胞培养表面。

28.如权利要求20所述的方法，其中，活化溶液包括活化剂和溶剂。

29.如权利要求20所述的方法，其中，活化剂包括n,n’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)或n-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯。

30.如权利要求20所述的方法，其中，溶剂包括非质子溶剂。

31.如权利要求20所述的方法，其中，聚半乳糖醛酸化合物包括下述中的至少一种：果胶酸、具有1摩尔％至40摩尔％酯化度或酰胺化度的部分酯化或酰胺化的果胶酸、或其盐。

32.如权利要求20所述的方法，其中，聚半乳糖醛酸化合物包含小于20摩尔％的甲氧基基团。

33.一种在可溶性载体上培养细胞的方法，所述方法包括：

34.如权利要求33所述的方法，其中，在可溶性载体上接种细胞包括：使细胞粘附于可溶性载体的表面。

35.如权利要求33所述的方法，其中，细胞聚集在可溶性载体的孔中以形成球体。

36.如权利要求33所述的方法，其中，使可溶性载体与细胞培养基接触包括：将可溶性载体浸没在细胞培养基中。

37.如权利要求33所述的方法，其中，使可溶性载体与细胞培养基接触包括：使细胞培养基连续通过可溶性载体。

38.如权利要求37所述的方法，其中，使细胞培养基连续通过可溶性载体包括：使至少一些细胞培养基不与可溶性载体接触，以及使可溶性载体与新鲜细胞培养基接触，以使得与可溶性载体接触的细胞培养基的体积保持基本上恒定。

39.一种从可溶性载体收获细胞的方法，所述方法包括：

40.如权利要求39所述的方法，其中，可溶性载体包括离子移变交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸、部分酯化的果胶酸、部分酰胺化的果胶酸及其盐，并且其中，酶包括非蛋白水解酶。

41.如权利要求40所述的方法，其中，所述非蛋白水解酶选自果胶裂解酶和果胶酶。

42.如权利要求39所述的方法，其中，消化可溶性载体包括：将可溶性载体暴露于约1u至约200u之间的酶。

43.如权利要求39所述的方法，其中，消化可溶性载体包括：将可溶性载体暴露于约1mm至约200mm之间的螯合剂。

技术总结
提供了活化的可溶性载体，其包括离子移变交联的化合物，该化合物包括具有至少一个重复单元的聚合物材料，所述重复单元包括离子移变交联的羧酸基团和活化的羟基基团，其中，羟基基团通过在溶剂中的N,N’‑二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)或N‑羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯活化以形成琥珀酰亚胺基碳酸酯基团用于配体结合。提供了形成活化的可溶性载体，在活化的可溶性载体上培养细胞，以及从可溶性载体收获细胞的方法。

技术研发人员：D·亨利,C·威尔莱克
受保护的技术使用者：康宁股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13