用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的方法与流程

发明领域本发明涉及一种用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的方法，一种用于生产全培养液酶组合物的基因修饰的丝状真菌细胞，此类基因修饰的丝状真菌细胞用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的用途，以及通过此类方法生产的丝状真菌全培养液酶组合物。

背景技术：

1、来自含木素纤维素(lignocellulose-containing)(或木质纤维素(lignocellulosic))生物质水解产物作为用于生产各种物质(例如，酶、乳酸、脂肪酸、异丁醇、丁二醇、琥珀酸、衣康酸以及乙醇)的有价值的底物越来越受到关注。源自这种方法的乙醇通常被称为“生物乙醇”或“生物燃料”。所需物质的生产通常通过涉及能够产生所需终产物的酵母、细菌或真菌的发酵方法进行。

2、此类方法的一个主要缺点是木质纤维素生物质底物本身。通常被称为“木质纤维素底物”的所有生物质含有相当大量的木质素(lignin)(至多40wt％)、纤维素(至多55wt％)和半纤维素(至多55wt％)。由于其来源(木材或杂草植物衍生的生物质)，细胞壁的结构也显著不同于将影响底物水解的大多数其它的那些植物物种。水解可以通过施用化学品(例如酸)来实现，但通常通过酶的消化来进行，其没有例如由化学处理产生的盐来污染水解产物。

3、这些聚合物的必要水解分解涉及使用几种纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和氧化还原酶。为了避免昂贵地补充单一特定的酶，此类水解分解通常通过施用所谓的“全培养液酶组合物”来进行，其由能够产生用于底物水解所必需的所有酶的微生物(例如丝状真菌)产生。然后，当使用普通的面包酵母时，所得的葡萄糖和纤维寡糖可以容易地发酵为所需的终产物，例如乙醇。

4、为了获得经济可行性，所需终产物的高产率以及所产生的全培养液酶组合物的高产率是必要的。这尤其适用于当最终产物是生物乙醇时，其必须与市场上的普通且廉价的矿物油衍生的燃料产物竞争。由纤维素和半纤维素以高产率生产单糖远比由含糖或含淀粉作物(例如甘蔗或玉米)衍生糖困难得多(van dyck and pletschke,2012)。因此，尽管木质纤维素生物质的成本远低于糖和淀粉作物的成本，但从此类材料获得糖用于发酵成例如生物乙醇的成本通常被认为太高而不能在工业上可行。为此，关键是解决木质纤维素生物质转化为水解产物中涉及的问题。

5、一个问题是用于生产全培养液酶组合物所需要的真菌，尤其是丝状真菌的发酵培养液的高粘度。为了获得高产率的酶，期望真菌的旺盛生长，然而，旺盛生长伴随发酵培养液中真菌生物质的高含量。已知由i.a.菌丝组成的真菌在本领域中已知能使任何发酵底物成为高粘度组合物。当使用呈现海绵状、粘滑外观的丝状真菌时，这种效果显著更明显。

6、高粘度引起许多问题，因为真菌在生长期间需要通过通气持续供氧。此外，需要冷却发酵罐，尤其是在工业规模生产中。两者仅可以通过持续搅拌来保证-一方面将空气气泡均匀地分布在培养液内，并且另一方面便于与冷却装置进行持续的热交换。培养液的粘度越高，在反应器内实现有效搅拌需要消耗的能量越多。此外，被压入到反应器的空气越多，压缩机和无菌过滤器单元内的能量消耗也越高。因此，capex和opex都随着发酵培养液粘度的增加而增加。替代措施-减少细胞产量-对于商业生产也不具有吸引力，因为这总是伴随着较低的全培养液酶产量。

7、由于木质纤维素生物质是已经提供了若干挑战的底物，当将此类方法应用于商业规模生产时，必须避免任何进一步的成本增加。

8、因此，本发明的发明人自己设定了开发用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的方法的任务，同时维持培养液内酶的高产率。

技术实现思路

1、该任务已经通过用于生产全培养液酶组合物的方法解决，其包含以下步骤：

2、(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，其葡萄糖含量为5至450g/l、木糖含量为2至300g/l、密度为1至2kg/l和干物质含量为10至75wt％；

3、(b)加入至少一种丝状真菌细胞，其中seq id no:1已被破坏；

4、(c)在20至35℃的温度下，将所述发酵培养基和所述至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间；

5、(d)获得全培养液酶组合物。

技术特征：

1.一种用于生产全培养液酶组合物的方法，其包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中根据步骤(a)的所述发酵培养基的ph已被调节至选自ph 2.0至6.0的ph值。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖与所述木糖的比率为1.0至3.5。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤：

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤(a)的所述发酵培养基中糠醛的含量为小于0.5g/l。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤(a)的所述发酵培养基羟甲基糠醛(hmf)的含量为小于0.5g/l。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤：

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间加入0.05wt％至5wt％的氮。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间加入0.5至350mg/l feso4、mnso4、mgso4和/或znso4。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自枝顶孢菌属、曲霉属、毛壳菌属、裸孢壳属(emericella)、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属(hypocrea)、耙菌属(irpex)、巨座壳属(magnaporte)、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶。

13.一种丝状真菌细胞，其中seq id no：1已被破坏。

14.根据权利要求13所述的丝状真菌细胞，其中seq id no：1已经通过以下而被破坏：启动子或任何其它调节序列的缺失、突变、修饰，终止密码子产生，或rna干扰。

15.根据权利要求13或14中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是基因修饰的丝状真菌细胞，其具有表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白的能力。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是基因修饰的丝状真菌细胞，其包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。

17.根据权利要求1至12中任一项所定义的方法生产的全培养液酶组合物。

18.根据权利要求13至16中任一项所定义的丝状真菌细胞用于生产全培养液酶组合物的用途。

19.根据权利要求18的全培养液酶组合物用于水解木质纤维素生物质的用途。

技术总结
本发明涉及用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的方法、用于生产全培养液酶组合物的基因修饰的丝状真菌、此类基因修饰的丝状真菌在生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物中的用途以及通过此类方法生产的丝状真菌全培养液酶组合物。

技术研发人员：C·加茂夫,J·克拉伦
受保护的技术使用者：科莱恩产品 （德国） 公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13