与淀粉酶信号肽一起表达的分散蛋白的制作方法

本发明涉及包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的核酸构建体，该第一多核苷酸编码来自细菌α-淀粉酶的信号肽，该第二多核苷酸编码具有氨基己糖苷酶活性的多肽；包含所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞；以及用于产生具有氨基己糖苷酶活性的多肽的方法。

背景技术：

1、工业生物技术的产品开发面临持续挑战，以期大规模提高酶产量从而降低成本。在过去的几十年中，为此目的采取了两种主要方法。第一种方法是基于经典的诱变和筛选。在这里，特定的基因修饰不是预先定义的，并且主要要求是对检测产量增量敏感的筛选测定。高通量筛选使得能够筛选大量突变体以寻找所希望的表型，即更高的酶产量。第二种方法包括许多策略，范围为从使用更强的启动子和多拷贝菌株以确保目的基因的高表达，到使用密码子优化的基因序列来帮助翻译。然而，给定蛋白质的高水平产生可能又触发细胞机制中将目的酶分泌到培养基中的几个瓶颈问题，这突出了对另外的优化策略的需要。

2、信号肽(sp)是存在于许多新合成多肽的氨基末端的短氨基酸序列，它们将这些多肽靶向进入或穿过细胞膜，从而帮助成熟和分泌。sp的氨基酸序列影响分泌效率，并从而影响多肽制造过程的产量。生物信息学工具(如signalp和signalp5)可以从氨基酸序列预测sp，但大多数工具无法区分各种类型的sp(armenteros等人,nat.biotechnol.[自然生物技术]37:420-423,2019)。此外，sp的氨基酸序列中的大量冗余使得难以预测任何给定的sp用于以工业规模生产酶的效率。因此，sp选择是制造重组蛋白质的重要步骤，但信号肽和成熟蛋白质的最佳组合非常依赖于情境，并且不容易预测。

3、分散蛋白(dispersin)是糖苷水解酶20(gh20)家族的一个亚组，它催化n-乙酰基-葡糖胺聚合物(聚-n-乙酰葡萄糖胺，pnag)的β-1,6-糖苷键的水解，这些聚合物见于例如由细菌产生的生物膜中。在许多情况下，生物膜形成不是人们所需要的，并且在许多应用中希望去除生物膜，这些应用包括医学清洁、衣物洗涤、餐具清洗、伤口护理和口腔护理。例如，wo 2004/061117a2(kane biotech公司)描述了包含分散蛋白b(dspb)的组合物用于减少和预防由产生聚-n-乙酰葡糖胺的细菌导致的生物膜的用途，wo 1998/50512(宝洁公司(procter and gamble))提供了包含一种或多种氨基己糖苷酶的衣物洗涤或清洁产品，并且wo 2017/186943(诺维信公司(novozymes a/s))披露了适用于洗涤剂和物品的深度清洁(如衣物洗涤和清洁过程)的分散蛋白。

技术实现思路

1、本发明基于令人惊讶和创造性的发现，即与同天然或其他信号肽一起表达的分散蛋白相比，同来自细菌α-淀粉酶的信号肽一起表达的相同分散蛋白提供了改善的分散蛋白产量。

2、在第一方面，本发明涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含：

3、a)第一多核苷酸，该第一多核苷酸编码来自细菌α-淀粉酶的信号肽；和b)第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码具有氨基己糖苷酶活性的多肽；

4、其中该第一多核苷酸和该第二多核苷酸以翻译融合方式可操作地连接。

5、在第二方面，本发明涉及表达载体，这些表达载体包含根据第一方面所述的核酸构建体。

6、在第三方面，本发明涉及宿主细胞，这些宿主细胞包含根据第一方面所述的核酸构建体和/或根据第二方面所述的表达载体。

7、在第四方面，本发明涉及用于产生具有氨基己糖苷酶活性的多肽的方法。

技术特征：

1.一种核酸构建体，该核酸构建体包含：

2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中该核酸构建体进一步包含异源启动子，并且其中所述启动子、该第一多核苷酸和该第二多核苷酸可操作地连接。

3.根据权利要求2所述的核酸构建体，其中该启动子是cryiiia启动子或基于cryiiia的启动子；优选地，该异源启动子是包含该cryiiia启动子的串联启动子或衍生自该cryiiia启动子的串联启动子。

4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该信号肽是天然存在的信号肽、或天然存在的信号肽的功能性片段或功能性变体。

5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该信号肽来自由芽孢杆菌属物种表达的α-淀粉酶；优选地，该信号肽衍生自由芽孢杆菌属物种表达的α-淀粉酶，该芽孢杆菌属物种选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞；更优选地，该信号肽衍生自由地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌表达的α-淀粉酶；最优选地，该信号肽来自由地衣芽孢杆菌表达的α-淀粉酶。

6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该信号肽与seq id no:2具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；优选地，该信号肽包含seqid no:2、基本上由其组成、或由其组成。

7.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该具有氨基己糖苷酶活性的多肽是微生物多肽，优选地细菌多肽。

8.根据权利要求7所述的核酸构建体，其中该具有氨基己糖苷酶活性的多肽属于土地芽孢杆菌属进化枝并且包含基序[vim][liv]g[gav]de[vi][psa](seq id no:11)。

9.根据权利要求7-8中任一项所述的核酸构建体，其中该具有氨基己糖苷酶活性的多肽与seq id no:4、seq id no:6、或seq id no:8或seq id no:10的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的核酸构建体，其中该具有氨基己糖苷酶活性的多肽包含seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8或seq id no:10的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成。

11.一种表达载体，该表达载体包含根据权利要求1-10中任一项所述的核酸构建体。

12.一种细菌宿主细胞，该细菌宿主细胞在其基因组中包含：

13.根据权利要求12所述的细菌宿主细胞，其中该细菌宿主细胞是革兰氏阳性宿主细胞。

14.根据权利要求12-13中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该细菌宿主细胞是芽孢杆菌属细胞；优选地，芽孢杆菌属细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞，最优选地衣芽孢杆菌细胞。

15.一种产生具有氨基己糖苷酶活性的多肽的方法，该方法包括：

技术总结
本发明涉及包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的核酸构建体，该第一多核苷酸编码来自细菌α‑淀粉酶的信号肽，该第二多核苷酸编码具有氨基己糖苷酶活性的多肽；包含所述核酸构建体的表达载体和宿主细胞；以及用于产生具有氨基己糖苷酶活性的多肽的方法。

技术研发人员：M·唐
受保护的技术使用者：诺维信公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14