用于治疗实体瘤的靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（GPC1）的含IGG4铰链的嵌合抗原受体的制作方法

本公开涉及优化的肿瘤抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1,gpc1)特异性嵌合抗原受体(car)，其包括来自igg4的铰链区。本公开进一步涉及靶向gpc1的含有igg4铰链的car用于治疗实体瘤的用途。政府支持的确认本发明是在美国国立卫生研究院授予的项目编号z01 bc010891的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。

背景技术：

1、cd19嵌合抗原受体(car)t细胞治疗复发和难治性b细胞恶性肿瘤后出现了明显的反应，这导致美国食品药品监督管理局(fda)批准了两种cd19 car t细胞产品(porter etal.,n engl j med 2011；365:725-733；kochenderfer et al.,blood 2012；119:2709-2720)。然而，新出现的随访数据表明，仅30％至50％的患者受到了长期疾病控制(maude etal.,n engl j med 2018；378:439-448；park et al.,n engl j med 2018；378:449-459)。为了提高b细胞恶性肿瘤的应答率并将car t细胞的成功转至实体瘤，需要对此类疗法进行优化。已有人提出，铰链(也称为间隔子)的长度对于为免疫突触形成提供足够的细胞内距离很重要(srivastava et al.,trends immunol 2015；36:494-502)。间隔子还提供了接近靶抗原的灵活性(guest et al.,j immunother 2005；28:203-211)。已发现从修饰的igg4铰链和fc结构域定制间隔子可提高car t细胞的体内抗肿瘤功效(hudecek et al.,clincancer res 2013；19:3153-3164；hudecek et al.,cancer immunol res 2015；3:125-135；jonnalagadda et al.,mol ther 2015；23:757-768)。

2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(gpc1)是糖基磷脂酰肌醇锚定细胞表面蛋白。它主要在胚胎发育过程中在神经和骨骼系统中表达，并在成人组织中以低水平表达(awad et al.,atlas genet cytogenet oncol haematol 2014；18:461-464)。gpc1的表达在胰腺癌中升高，包括癌细胞和邻近的成纤维细胞，而在正常胰腺中很少发现其表达(duan et al.,asian j surg 2013；36:7-12；kleeff et al.,j clin invest 1998；102:1662-1673)。两种抗gpc1单克隆抗体，克隆01a033和克隆1-12，已被用于开发针对gpc1阳性肿瘤细胞的抗体-药物缀合物(adc)和car t细胞，并在临床前模型中被发现具有抗肿瘤功效(harada etal.,oncotarget 2017；8:24741-24752；kato et al.,int j cancer 2018；142:1056-1066；matsuzaki etal.,int j cancer 2018；142:1056-1066；nishigaki et al.,br jcancer 2020；122:1333-1341)。

3、人们已经注意到gpc1在胰腺癌中的不同表达水平。研究表明，在阳性染色的胰腺肿瘤组织(n＝111)中，51.4％的gpc1呈弱染色，35.1％的gpc1呈中度染色，以及13.5％的gpc1呈强染色(lu et al.,cancer med 2017；6:1181-1191)。抗原密度已成为影响car t细胞活性的主要因素(majzner and mackall,cancer discov 2018；8:1219-1226；shah andfry,nat rev clin oncol 2019；16:372-385)。car t细胞效力高度依赖于靶抗原表达，并且当抗原表达较低或低于某个阈值时，car经常无法发挥其抗肿瘤活性。car设计中的铰链和跨膜(tm)变化可以调整最佳car t细胞活性所需的抗原密度阈值(majzner et al.,cancer discov 2020；10:702-723)。

技术实现思路

1、本文描述的是优化的具有特定铰链和跨膜区的gpc1特异性嵌合抗原受体(car)的开发。在一些情况下，car由对gpc1的n-lobe(膜远端)或c-lobe(膜近端)具有高亲和力的抗体(或其抗原结合片段)组成。本文公开了car的铰链和跨膜结构域对t细胞功能产生重大影响，特别是当表达gpc1的癌细胞上的gpc1密度偏低时。

2、本文提供了一种car，其包括gpc1特异性细胞外抗原结合结构域；igg4铰链序列；跨膜结构域；细胞内共刺激结构域；和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，car包括由如seq id no:7所示的igg4铰链区组成的铰链区。在一些实施方案中，car的抗原结合结构域特异性结合gpc1的膜远端表位。在一些实例中，抗原结合结构域包括gpc1特异性单域抗体d4的cdr序列或gpc1特异性抗体hm2的vh和vl cdr序列。在一些实例中，car的跨膜结构域是cd28跨膜结构域。在其他实例中，car的跨膜结构域是cd8α跨膜结构域。

3、进一步提供了编码所公开的car的核酸分子。在一些实施方案中，该核酸分子在5’至3’方向上包括编码第一粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(gmcsfrss)的核酸；编码抗原结合结构域的核酸；编码igg4铰链区的核酸；编码跨膜结构域的核酸；编码共刺激结构域的核酸；编码信号传导结构域的核酸；编码自切割2a肽的核酸；编码第二gmcsfrs的核酸；和编码截短的人表皮生长因子受体(huegfrt)的核酸。在一些实例中，该核酸分子进一步包括在编码第一gmcsfrss的核酸的5’端的人延伸因子1α(ef1α)启动子序列。进一步提供了包括所公开的核酸分子的载体。

4、还提供了表达本文所公开的car和/或含有本文所公开的分离的核酸分子或载体的分离的免疫细胞，例如t细胞、nk细胞或巨噬细胞。

5、进一步提供了包括药学上可接受的载体和本文所公开的car、核酸分子、载体或细胞的组合物。

6、还提供了治疗受试者的gpc1阳性癌症或抑制gpc1阳性癌症的肿瘤生长或转移的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所公开的car、核酸分子、载体、细胞或组合物。在一些实例中，gpc1阳性癌症是实体瘤。在一些实例中，gpc1阳性癌症是具有低密度(例如低表达)gpc-1的肿瘤，例如每个细胞表达少于2500个gpc1分子的肿瘤。

7、本公开的前述和其他目的和特征将从以下参考附图进行的详细描述中变得更加显而易见。

技术特征：

1.嵌合抗原受体(car)，所述car包含：

2.根据权利要求1所述的car，其中所述抗原结合结构域包含gpc1特异性单域抗体。

3.根据权利要求2所述的car，其中所述单域抗体包含seq id no:6的互补决定区1(cdr1)、cdr2和cdr3序列。

4.根据权利要求3所述的car，其中所述cdr1、cdr2和cdr3序列分别包含：

5.根据权利要求3或权利要求4所述的car，其中所述单域抗体的氨基酸序列与seq idno:6具有至少90％同一性并且包含seq id no:6的cdr1、cdr2和cdr3序列。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的car，其中所述单域抗体的氨基酸序列包含seq idno:6或由其组成。

7.根据权利要求1所述的car，其中所述抗原结合结构域包含gpc1特异性scfv。

8.根据权利要求7所述的car，其中所述scfv包含可变重链(vh)结构域和可变轻链(vl)结构域，并且所述vh结构域包含seq id no:2的互补决定区1(cdrl)、cdr2和cdr3序列，并且所述vl结构域包含seq id no:4的cdr1、cdr2和cdr3序列。

9.根据权利要求8所述的car，其中所述vh结构域cdr1、cdr2和cdr3序列分别包含：

10.根据权利要求8或权利要求9所述的car，其中所述vl结构域cdr1、cdr2和cdr3序列分别包含：

11.根据权利要求8-10中任一项所述的car，其中：

12.根据权利要求8-11中任一项所述的car，其中：

13.根据权利要求8-12中任一项所述的car，其中所述scfv包含seq id no:18的残基25-265的氨基酸序列。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的car，其中所述跨膜结构域包含cd28跨膜结构域。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的car，其中所述共刺激结构域包含4-1bb信号传导部分。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的car，其中所述信号传导结构域包含cd3ζ信号传导结构域。

17.一种分离的细胞，所述分离的细胞表达权利要求1-16中任一项的car。

18.根据权利要求17所述的分离细胞，其是t细胞、自然杀伤(nk)细胞或巨噬细胞。

19.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-16中任一项的car。

20.根据权利要求19所述的核酸分子，其可操作地连接至启动子。

21.根据权利要求19所述的核酸分子，其在5’至3’方向上包含：

22.根据权利要求21所述的核酸分子，进一步包含在编码所述第一gmcsfrss的核酸的5’端的人延伸因子1α(ef1α)启动子序列。

23.载体，所述载体包含权利要求19-22中任一项的核酸分子。

24.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。

25.分离的细胞，所述分离的细胞包含权利要求19-22中任一项的核酸分子或者权利要求23或权利要求24所述的载体。

26.根据权利要求25所述的分离细胞，其是t细胞、nk细胞或巨噬细胞。

27.组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体以及权利要求1-16中任一项的car，权利要求17、18、25和26中任一项的细胞，权利要求19-22中任一项的核酸分子或者权利要求23或权利要求24的载体。

28.治疗受试者的gpc1阳性癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-16中任一项的car，权利要求17、18、25和26中任一项的细胞，权利要求19-22任一项的核酸分子，权利要求23或权利要求24的载体，或权利要求27的组合物。

29.抑制受试者的gpc1阳性癌症的肿瘤生长或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-16中任一项的car，权利要求17、18、25和26中任一项的细胞，权利要求19-22任一项的核酸分子，权利要求23或权利要求24的载体，或权利要求27的组合物。

30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述gpc1阳性癌症是实体瘤。

31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述gpc1阳性癌症是胰腺癌、结直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、骨肉瘤、子宫内膜癌、乳腺癌或卵巢癌。

32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述gpc1阳性癌症每个细胞表达不超过约2500个、不超过2000个、不超过1500个或不超过1000个gpc1分子。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述gpc1阳性癌症是胰腺癌。

技术总结
描述了靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1(GPC1)的优化的嵌合抗原受体(CAR)，其包括来自IgG4的12‑氨基酸铰链区。优化的CAR包括来自CD8或CD28的跨膜结构域。表达优化的CAR的免疫细胞，例如T细胞或自然杀伤细胞，可用于治疗GPC1阳性实体瘤。

技术研发人员：何苗壮,李楠,J·D·洪
受保护的技术使用者：美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13