重组HVT及其用途的制作方法

本发明涉及编码不同抗原的重组禽疱疹病毒及其用途。本发明适于生产使禽类物种针对禽类病原体免疫的疫苗。

背景技术：

1、禽肉和禽蛋是重要的食物来源，由于人口的增长和它们巨大的性价比，它们的消耗不断增加。为了确保家禽健康以及食物安全和保障，家禽疫苗技术已经成为全世界关注的问题。

2、表达病原体蛋白的病毒载体通常用作针对靶向病原体的家禽疫苗。包括此类病毒载体的疫苗诱导外源病原体蛋白在受感染的宿主内的表达，这可导致保护性免疫。

3、已经研究了许多不同类别的病毒作为禽类疫苗接种的候选载体，诸如腺病毒、aav、鸡痘病毒、疱疹病毒等。

4、已经确定了三种类型的疱疹病毒，mdv1、mdv2和mdv3(也称为火鸡疱疹病毒(hvt))。所述病毒之间存在高度相似性(参见kingham等人，journal of general virology(2001)82,1123-1135)，并且它们全部已经用于制备重组病毒，其中已经整合了源自病原体的外源基因，用作禽类特别是家禽诸如鸡的疫苗。

5、尽管此类疫苗制剂为禽类物种接种针对许多疾病的疫苗提供了有效的结果，但是当禽类注射两种或更多种各自编码不同抗原的重组疱疹病毒时，病原体之间可发生竞争和免疫抑制。

6、为了克服此类干扰以及利于针对多种疾病的疫苗接种，已经进行了各种尝试来产生编码几种抗原的多价疱疹病毒。

7、首先研究将几个基因插入疱疹病毒基因组的单个克隆位点中(参见例如，ep1026246)。然而，此类构建体并未提供所需水平的保护性免疫或者证明是不稳定的，在培养细胞中重复传代期间全部或部分外源基因缺失。

8、wo2013/144355和wo2020/127964报道了使用位于病毒基因组非编码区中的克隆位点的组合获得的编码多种外源抗原的稳定疱疹病毒。

9、wo2013/057236、wo2013/082327和wo2013/082317报道了通过在疱疹病毒的us2编码序列内克隆至少一个基因来设计多价hvt的另一种方法。

10、考虑到病原体的数目和物种，本领域需要另外的可以稳定地在体内表达多种基因并且适于禽类特别是家禽的疫苗接种的重组多价疱疹病毒。

技术实现思路

1、本发明提供了在病毒基因组的至少两个单独位置包含至少两个重组核苷酸序列的重组禽疱疹病毒。

2、更具体地，本发明提供了重组火鸡疱疹病毒(hvt)，所述重组火鸡疱疹病毒包含(i)插入病毒基因组的第一插入位点中的编码新城疫病毒的f蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入所述病毒基因组的第二插入位点中的编码h9亚型禽流感病毒的血凝素(ha)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列，所述第一插入位点和所述第二插入位点位于选自ul45与ul46之间的非编码区和sorf3与us2之间的非编码区的所述病毒基因组的不同非编码区中。

3、本发明还涉及包含如以上定义的重组hvt的基因组的核酸，并且涉及含有此类核酸的载体(诸如质粒)。

4、本发明还涉及新型抗原和编码这些抗原的核酸分子。

5、本发明还涉及含有如以上定义的重组hvt或核酸或载体的细胞。

6、本发明的另一个目的是包含如以上定义的重组hvt和合适的赋形剂或稀释剂的组合物。

7、本发明的另一个目的是包含如以上定义的核酸核酸或细胞和合适的赋形剂或稀释剂的组合物。

8、本发明的另一个目的在于一种疫苗，该疫苗包含有效免疫量的如以上定义的重组hvt、核酸和/或细胞。

9、本发明的另一个目的在于如以上定义的重组hvt、核酸或细胞，用于使禽类诸如家禽针对新城疫病毒(ndv)和禽流感病毒(aiv)和/或相关疾病免疫。

10、本发明的另一个目的在于如以上定义的重组hvt、核酸或细胞，用于保护禽类诸如家禽免于ndv和aiv引起的疾病。

11、本发明的另一个目的在于如以上定义的疫苗，用于为禽类诸如家禽接种针对ndv和aiv的疫苗。

12、本发明的另一个目的在于一种用于为禽类接种疫苗的方法，该方法包括向禽类施用如以上定义的组合物或疫苗或病毒。

13、本发明的另一个目的在于用于在禽类中诱导对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向禽类施用如以上定义的组合物或疫苗或病毒。

14、本发明还提供了用于使禽类免疫的疫苗接种试剂盒，该疫苗接种试剂盒包含以下组分：

15、a.有效量的如以上定义的组合物或疫苗，和

16、b.用于将所述组合物或疫苗施用于所述禽类的工具。

17、本发明可用于任何禽类，用于针对ndv和/或aiv和/或相关病症或病状进行疫苗接种。本发明特别适合为家禽诸如鸡接种疫苗。

1.一种重组火鸡疱疹病毒(rhvt)，所述重组火鸡疱疹病毒包含(i)插入病毒基因组的第一插入位点中的编码新城疫病毒的f蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入所述病毒基因组的第二插入位点中的编码h9亚型禽流感病毒的血凝素(ha)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列，所述第一插入位点和所述第二插入位点位于选自ul45与ul46之间的非编码区和sorf3与us2之间的非编码区的所述病毒基因组的不同非编码区中。

2.根据权利要求1所述的rhvt，所述rhvt包含(i)插入位于ul45与ul46之间的所述病毒基因组的非编码区中的编码新城疫病毒的f蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入位于sorf3与us2之间的所述病毒基因组的非编码区中的编码h9亚型禽流感病毒的血凝素(ha)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的rhvt，所述rhvt包含(i)插入位于sorf3与us2之间的所述病毒基因组的非编码区中的编码新城疫病毒的f蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入位于ul45与ul46之间的所述病毒基因组的非编码区中的编码h9亚型禽流感病毒的血凝素(ha)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的rhvt，其中所述血凝素(ha)蛋白是h9n2亚型禽流感病毒。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的rhvt，其中编码所述ha蛋白的所述序列选自seqid no:8至13。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的rhvt，其中编码所述ha蛋白的所述序列处于cmv立即早期启动子的控制下，优选地处于鼠或人cmv立即早期启动子的控制下。

7.根据权利要求6所述的rhvt，其中mcmv ie1启动子包含seq id no:15的序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的rhvt，其中编码所述f蛋白的所述序列处于pec启动子的控制下，优选地其中所述pec启动子包含seq id no:14的序列。

9.一种疫苗，所述疫苗包含根据权利要求1至8中任一项所述的rhvt。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的rhvt，所述rhvt用于为禽类诸如家禽，优选鸡接种疫苗。

11.一种多肽，所述多肽包含选自seq id no:2至7中任一个的序列、基本上由所述序列组成或由所述序列组成。

12.一种编码根据权利要求11所述的多肽的核酸，优选地其中所述核酸包含选自seqid no:8至13中任一个的序列、基本上由所述序列组成或由所述序列组成。

13.一种载体，所述载体包含根据权利要求12所述的核酸，优选地其中所述载体是重组病毒。

14.一种重组细胞，所述重组细胞包含根据权利要求12所述的核酸或根据权利要求13所述的载体。

15.一种疫苗，所述疫苗包含根据权利要求11所述的多肽，或根据权利要求12所述的核酸，或根据权利要求13或14所述的载体或细胞。